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第Ⅰ部分：供蛋白质组学分析的蛋白样品制备 3

第1章 分离科学在蛋白质组学中的作用 3

制备纯化蛋白：蛋白质微阵和结构蛋白质组学的瓶颈 5

以质谱为基础的蛋白质鉴定 6

蛋白质组学所面临的一个关键技术的挑战：减少样品的复杂性 7

本书的概述 73

参考文献 14

选读文献 15

网络资源 15

第2章 蛋白质的纯化策略 16

挑战 17

蛋白质的量和纯度要求 17

重组蛋白通常能简化纯化过程 20

可根据蛋白质的内在特性来分离蛋白质 22

设计蛋白质纯化方案 26

应用：膜相关抗原A33的纯化 31

参考文献 35

选读文献 36

第Ⅱ部分：蛋白质组学中制备蛋白样品的色谱方法 39

第3章 蛋白质和肽纯化的色谱方法导论 39

基本概念 40

色谱性能 48

实验方案 60

方案1轻拍-填装法干式填装刚性固体柱 60

色谱术语表 62

参考文献 69

选读文献 69

网络资源 69

第4章 全蛋白的多维色谱 70

MDLC用于蛋白质分级分离的目的 71

策略 72

主要文献概述 74

MDLC的理论参数 75

色谱模式：正交性与相容性 77

与其他技术的性能比较 80

MDLC的常见问题 82

发展潜力 84

样品处理方案：SEC／反相色谱法分离大肠杆菌蛋白 84

研究实例：MDLC分析酵母蛋白提取物 88

结论 90

参考文献 91

第5章 可溶性重组蛋白的高通量筛选 93

引言 94

实验方案 97

方案1设计平行克隆表达载体 97

方案2平行克隆所用载体的制备 98

方案3黏末端PCR产物的制备和消化载体的连接 100

方案4把DNA转化到细菌中 103

方案5诱导和筛选可溶性融合蛋白 106

参考文献 110

第6章 离子交换色谱 111

IEC利用了分子间的静电力 112

几种IEC的模式 115

IEC中缓冲液的选择很重要 115

离子交换介质和色谱分离装置 118

实验方案 121

方案1离子交换柱的选择 121

方案2离子交换柱的制备 125

方案3用IEC分离蛋白质 127

IEC柱的清洗 130

IEC的优化和常见问题 131

参考文献 134

网络资源 134

离子交换介质的供应商 134

第7章 尺寸排阻色谱 135

小分子更易进入凝胶介质间的空隙 136

分配系数Kd和有效分配系数Kav描述了溶质在特定凝胶中的洗脱情况 137

SEC分离相似形状分子的能力取决于凝胶的选择范围 139

分子的形状对其洗脱时间的影响 139

影响洗脱蛋白分辨率的因素 140

SEC在纯化方案中的作用 141

SEC中缓冲液、溶液和试剂的配制 141

SEC中蛋白样品和肽样品的预处理 142

SEC液相色谱装置 142

利用SEC分离纯化的例子 147

实验方案 151

方案1尺寸排阻色谱柱的填装 151

方案2尺寸排阻色谱的制备 154

附加方案：分析性尺寸排阻色谱 157

方案3用尺寸排阻色谱进行蛋白质的脱盐和缓冲液的更换 158

柱的清洗和保养操作 159

关于SEC的常见问题 161

参考文献 162

第8章 反相高效液相色谱在蛋白质分离和纯化中的应用 163

RP-HPLC的特点与机制 164

分离机制 165

RP-HPLC基于“疏水脚”的细微差异分离多肽 166

RP-HPLC柱的特点与操作 166

流动相 171

温度 174

表面活性剂对反相分离的影响 174

在质谱鉴定前用RP-HPLC分级分离多肽 174

RP-HPLC常见问题指南 176

实验方案 177

方案1 RP-HPLC分离蛋白质的标准色谱条件 177

方案2 RP-HPLC分离多肽的标准色谱条件 183

参考文献 188

选读文献 188

网络资源 188

第9章 疏水相互作用色谱 189

HIC与RP-HPLC的区别 190

HIC的基本原理 191

实验的影响因素 192

实验方案 196

方案1用HIC分离蛋白质 196

参考文献 198

第10章 亲和色谱与免疫亲和色谱 199

亲和色谱的实际应用 201

凝集素亲和色谱 202

配基亲和色谱 205

免疫亲和色谱 206

DNA亲和色谱 207

共价色谱 210

采用巯基-二硫键互换反应的共价色谱 211

实验方案 215

方案1凝集素-琼脂糖凝胶亲和色谱 215

方案2蛋白质配基亲和色谱 218

方案3制备抗体亲和树脂过程中抗体的定位 221

方案4 DNA亲和柱的制备 223

方案5 DNA亲和色谱 227

方案6从仅被混有不可逆失活的亚磺酸氧化产物中以可逆失活混合的二硫化物形式纯化木瓜蛋白酶 232

方案7以琼脂糖-谷胱甘肽-2-吡啶二硫化物凝胶作为填料的共价色谱 235

方案8使用活化的Thiopropyl-Sepharose 6B凝胶的共价色谱 241

参考文献 249

网络资源 250

第11章 蛋白质组学研究中的染料配基亲和色谱 251

方法的设计和优化 254

染料配基吸附剂的再生和储存 258

实验方案 259

方案1染料在多羟基介质中的固定化 259

附加方案：固定化配基浓度的测定 262

方案2通过结合目的蛋白的能力来筛选固定化染料 263

方案3吸附条件的优化 265

方案4洗脱条件的优化 266

方案5分批式试管法计算吸附剂的有效容量 268

方案6用染料配基亲和色谱纯化蛋白 269

研究实例：使用Cibacron Blue 3GA-Sepharose亲和吸附剂纯化重组甲酸脱氢酶 271

参考文献 272

第12章 固定化金属离子亲和色谱 273

IMAC的基本原理 274

IMAC的基本操作 276

IMAC最常用于纯化带多聚组氨酸标签的蛋白质 277

目的蛋白性质未知时可使用IMAC 278

磷蛋白和磷酸肽的分离 278

实验方案 280

方案1IMAC预装柱的准备 280

方案2填装IMAC柱 281

方案3制备含组氨酸标签蛋白的大肠杆菌澄清提取物 283

方案4～6的导言：在非变性条件下纯化组氨酸标签蛋白 285

方案4利用未经参数优化的IMAC纯化组氨酸标签蛋白 286

方案5优化咪唑浓度来提高蛋白质分离效率 288

方案6利用咪唑梯度用IMAC纯化组氨酸标签蛋白 291

方案7～8的导言：在变性条件下用IMAC纯化组氨酸标签蛋白 294

方案7变性蛋白样品的制备 295

方案8在变性条件下用IMAC纯化组氨酸标签蛋白 297

IMAC柱的清洗 300

IMAC柱的保存 300

IMAC疑难问题的解决 300

12.6 IMAC研究实例 303

参考文献 305

第13章 用羟磷灰石进行蛋白质色谱 307

基本概念 308

应用 312

实验方案 315

方案1用羟磷灰石结晶粉进行色谱 315

方案2用陶瓷羟磷灰石进行高效液相色谱 318

参考文献 322

第14章 色谱聚焦 323

引言 324

实验方案 327

方案1制备凝胶和柱子 327

方案2制备样品：变换缓冲液和脱盐 332

方案3利用色谱聚焦法纯化蛋白 335

方案4从样品组分中去除Polybuffer和Pharmalyte 338

方案5柱子的清洗、再生和保存 340

色谱聚焦研究实例 343

参考文献 346

第Ⅲ部分：蛋白质组学中制备蛋白样品的电泳方法 349

第15章 电泳分离蛋白质策略导论 349

通过制备电泳富集低丰度蛋白 353

第Ⅲ部分概述 355

参考文献 357

第16章 双向凝胶电泳分离蛋白质 359

样品的制备 360

预分离和亚分离操作 362

用IPG进行双向凝胶电泳 363

IPG-IEF的一般指导原则 363

蛋白质的显示 368

差示凝胶电泳 369

2D胶疑难问题的处理 370

实验方案 371

方案1细胞和组织样品的提取和增溶 371

方案2小麦种子（T.aestivum）蛋白质的顺序提取 375

方案3用Sephadex-IEF进行小鼠肝脏蛋白的预分离 377

方案4 IPG胶条用IPGphor单元来进行IEF 381

方案5 IPG胶条的平衡 385

方案6在垂直电泳单元中进行的多个SD-PAGE 387

方案7荧光差示凝胶电泳 390

参考文献 394

网络资源 395

第17章 在MCE中通过等电位分段法进行高分辨率双向凝胶电泳来制备样品 396

窄范围IPG可提高蛋白质分辨率 397

MCE将样品分成窄的等电位分段 398

实验方案 401

方案1MCE分段法 401

MCE血浆蛋白分段的结果 404

人血浆的窄范围碱性分段 405

玉米（ZEA MAYS）晶胚的分段 406

参考文献 407

第18章 一种电泳纯化蛋白质的方法：Gradiflow BF400仪 408

Gradiflow BF400仪的介绍 410

Gradiflow BF400仪的分离原理 411

用Gradiflow BF400仪进行分离的技术方案的发展 411

实施根据电荷进行的分离 413

实施根据大小进行的分离 414

实例分析：在蛋白质组学分析中按大小对蛋白样品进行分级分离 414

实验方案 416

方案1从血浆或血清中制备多克隆抗体 416

方案2从组织培养上清液中浓缩蛋白 419

方案3从血浆中去除清蛋白 421

Gradiflow BF400仪的特征 424

参考文献 425

第19章 用自由流动电泳技术纯化蛋白质 426

引言 427

实验方案 429

方案1天然IEF-FFE分级分离粗蛋白混合物 429

方案2变性IEF-FFE分级分离粗蛋白混合物 437

参考文献 439

第Ⅳ部分：用于结构蛋白质组学的纯化蛋白的分析 443

第20章 已纯化蛋白质鉴定方法导论 443

结构基因组学：是否可以从结构推知功能？ 444

蛋白质微阵的进展 445

已纯化蛋白的功能完整性 445

第Ⅳ部分概述 448

参考文献 450

网络资源 451

第21章 用质谱测定蛋白质的特性 452

一级结构的测定 453

二级结构的测定：二硫键 464

三级结构和四级结构的测定：蛋白质构象、蛋白质折叠和蛋白质-蛋白质相互作用 467

参考文献 474

第22章 分析超速离心：蛋白质大小、构象和相互作用 478

分析超速离心的原理 479

理论 480

文献示例 483

实验上的问题 487

结论 490

参考文献 491

网络资源 492

第23章 蛋白质构象稳定性的测定 493

用光谱学技术追踪去折叠 494

通过氢交换来测定蛋白质的构象稳定性 503

比较由NMR和其他方法测得的ΔGu 505

结束语 507

实验方案 508

方案1尿素储液的制备 508

方案2测定尿素或盐酸胍去折叠曲线 510

方案3测定热去折叠曲线 512

方案4用NMR法测定蛋白质构象的稳定性 514

参考文献 517

第24章 表面等离子体共振与质谱联用：鉴定结合配体及描述相互作用 519

SPR生物传感器 520

配体垂钓以及应用SPR生物传感器和质谱进行鉴定 520

实例分析：配体垂钓以及从脑提取物中鉴定钙调蛋白 522

参考文献 529

第25章 糖蛋白中糖的分析 530

历史背景 532

聚糖与蛋白质最常用的连接是通过天冬酰胺、羟基氨基酸和GPI锚 535

可以用多种方法检测蛋白质的糖基化 539

用化学方法和酶学方法可以从糖蛋白中释放聚糖 544

寡糖的混合物难以分离 548

可以用物理方法、化学方法和酶学方法描述聚糖的结构特征 553

实验方案 566

方案1用氟化氢使糖蛋白脱糖基 566

方案2单糖组成分析：糖醇乙酸酯 568

方案3用甲醇解法分析单糖 572

附加方案：磷酸化糖的重氮甲烷甲基化 574

方案4用NaOH甲基化方法进行连接分析 576

参考文献 580

网络资源 583

附录1 蛋白质结构概述 584

附录2 蛋白质浓度的测定 605

附录3 蛋白质溶液的浓缩 644

附录4 蛋白质的储存稳定性 672

附录5 单向聚丙烯酰胺凝胶电泳 688

附录6 疑难问题解决指南 702

附录7 注意事项 715

索引 728