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第一篇 植物基因工程的目的基因 1

第一章 抗植物病虫害基因及其应用 1

1.1抗植物虫害基因及其应用 2

1.1.1Bt基因及其应用 2

1.1.2蛋白酶抑制剂基因及其应用 6

1.1.3植物疑集素基因及其应用 8

1.1.4淀粉酶抑制剂基因及其应用 10

1.2抗植物病毒基因及其应用 10

1.2.1CP基因及其应用 10

1.2.2病毒复制酶基因及其应用 12

1.2.3病毒卫星RNA的利用 12

1.2.4核糖体失活蛋白基因及其应用 13

1.2.6缺陷干扰颗粒的利用 14

1.2.5干扰素基因及其应用 14

1.3抗植物真菌病害基因及其应用 15

1.3.1几丁质酶基因与β-1,3-葡聚糖酶基因及其应用 16

1.3.2植物抗毒素基因及其应用 17

1.3.3RIP基因及其应用 18

1.3.4过氧化物酶基因及其应用 18

1.4抗植物细菌病害基因及其应用 18

1.4.1病原菌本身的抗性基因及其应用 18

1.4.2杀菌肽基因及其应用 19

1.4.3溶菌酶基因及其应用 20

第二章 抗非生物胁迫、改良作物产品质量的基因及应用 21

2.1抗非生物胁迫基因及其应用 21

2.1.1耐除草剂基因及其应用 21

2.1.2抗其它非生物胁迫基因及其应用 26

2.2.1控制果实成熟期的基因及其应用 29

2.2改良作物品种质量的基因及其应用 29

2.2.2谷物种子贮藏蛋白基因及其应用 32

2.2.3改良脂肪酸组成的基因工程 34

2.3提高作物产量的基因及其应用 35

2.3.1植物光合作用机理及提高作物产量的设想 35

2.3.2提高作物产量的基因及其应用 36

第三章 改变植物其它性状的基因及植物医药基因工程 39

3.1植物甜味蛋白基因及其应用 39

3.2植物激素基因工程 39

3.2.1iaaM和iaaH基因及其应用 40

3.2.2ipt基因及其应用 41

3.3改变植物花色的基因及其应用 41

3.4植物雄性不育基因及其应用 42

3.4.1植物雄性不育的遗传基础 42

3.4.2植物雄性不育基因的应用 44

3.5植物医药基因工程 45

3.5.1植物医药基因工程的含义及意义 45

3.5.2在植物中表达抗体 46

3.5.3在植物中表达动物疫苗 50

第四章 基因克隆所需的工具酶和载体 53

4.1基因克隆所需的工具酶 53

4.1.1限制性内切酶 53

4.1.2DNA和RNA连接酶 58

4.1.3DNA聚合酶 59

4.1.4基因工程中所用的其它酶类 63

4.2基因克隆所需的载体 63

4.2.1质粒载体 64

4.2.2λ噬菌体载体 71

4.2.3粘粒载体 76

4.2.4单链噬菌体载体 77

第五章 目的基因的制备与克隆 82

5.1化学法合成目的基因 82

5.1.1磷酸二酯法 82

5.1.2亚磷酸三酯法 83

5.1.3寡核苷酸连接法 84

5.2基因文库的构建 85

5.2.1外源DNA大片段的制备 86

5.2.2用于基因文库构建的载体及其制备 86

5.2.3载体与外源DNA片段的连接 87

5.2.4体外包装及基因组DNA文库的扩增 87

5.3cDNA的合成和克隆 88

5.3.1mRNA的提取及其完整性的确定 88

5.3.2cDNA的合成与克隆 90

5.3.3目的cDNA克隆的鉴定 96

5.4多聚酶链式反应在目的基因制备中的作用 98

5.4.1多聚酶链式反应的原理 98

5.4.2PCR技术在目的基因制备中的应用 99

5.4.3PCR技术在分子克隆中的其它应用 100

第六章 重组体的构建及向宿主细胞的导入 104

6.1载体DNA的提取及纯化 104

6.1.1宿主细胞的培养和收获 104

6.1.2细胞的裂解 104

6.1.3质粒DNA的分离与纯化 105

6.2外源DNA片段与载体分子的连接-重组体的构建 106

6.2.1DNA连接酶的作用机理 106

6.2.2影响连接反应的因素 106

6.3重组体向受体细胞的导入 109

6.3.1转化 110

6.3.2转导和转染 112

6.3.3对宿主菌的要求 112

第七章 重组体的筛选与鉴定 114

7.1重组体的筛选 114

7.1.1遗传学方法 114

7.1.2核酸杂交法 115

7.1.3免疫学筛选法 119

7.1.4转译筛选法 121

7.1.5快速少量制备质粒DNA进行限制酶切分析 121

7.1.6重组探针法 122

7.2重组体的鉴定和分析 122

7.2.1限制酶切图谱 122

7.2.3插入失活定位 123

7.2.2亚克隆 123

7.2.4电子显微镜作图 124

7.2.5转录产物作图 125

7.2.6基因产物分析 125

7.2.7DNA序列分析 126

第八章 植物基因工程载体及其构建 134

8.1植物基因工程载体种类及命名规则 134

8.1.1植物基因工程载体的命名规则 134

8.1.2植物基因工程载体的种类及特性 134

8.2根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能 135

8.2.1Ti质粒的遗传特性、结构及功能 135

8.2.2T-DNA的基因结构与功能 140

8.2.3Vir区操纵子的基因结构与功能 143

8.3.1T-DNA的加工及转移 146

8.3农杆菌Ti质粒基因转化机理 146

8.3.2T链蛋白复合体的形成及VirE的功能 148

8.3.3T链复合体通过细菌膜的转运及VirB的功能 148

8.3.4T链复合体靶向植物细胞核 150

8.3.5T链整合植物基因组的分子机理 151

8.3.6农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控 153

8.4农杆菌Ti质粒的改造及载体构建 154

8.4.1Ti质粒的改造及卸甲载体构建 154

8.4.2中间载体的构建 156

8.4.3中间表达载体的构建 158

8.4.4植物基因转化载体系统的构建 160

8.5载体构建中常用的选择标记及报告基因 167

8.5.1选择标记的应用及原理 168

8.5.2报告基因的应用及原理 173

8.5.3选择标记和报告基因的选择策略 174

8.6常用的植物基因工程载体 175

8.6.1常用的植物基因工程中间表达载体 175

8.6.2植物基因工程常用的Cis载体（一元载体） 177

8.6.3植物基因工程常用的双元载体 178

第二篇 目的基因的转化 179

第九章 植物基因转化受体系统的建立 179

9.1植物基因转化受体系统的条件 179

9.2植物基因转化受体系统的类型及其特性 182

9.2.1愈伤组织再生系统 182

9.2.2直接分化再生系统 182

9.2.3原生质体再生系统 183

9.2.4胚状体再生系统 184

9.2.5生殖细胞受体系统 184

9.3.1高频再生系统的建立 185

9.3植物基因转化受体系统的建立程序 185

9.3.2抗生素敏感性试验 188

9.3.3农杆菌的敏感性试验及菌种的选择 189

9.4植物基因转化受体系统建立中常遇的问题 189

9.4.1试管苗的玻璃化现象 189

9.4.2培养物的褐化 190

9.4.3白化苗的产生 192

9.4.4试管苗的移栽成活率 193

第十章 根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化 194

10.1根癌农杆菌的生物学特性 195

10.1.1根癌农杆菌的形态结构、生活习性及寄主范围 195

10.1.2根癌农杆菌的分类及鉴定 195

10.1.4根癌农杆菌附着植物细胞的机理 196

10.2根癌农杆菌侵染植物细胞的化学机理 196

10.1.3根癌农杆菌的遗传寄主及内共生原理 196

10.2.1根癌农杆菌的趋化性 198

10.2.2根癌农杆菌侵染的诱导物及作用机理 198

10.2.3冠瘿碱的化学特性及功能 201

10.3根癌农杆菌的侵染能力及其特异性 205

10.3.1基因转化中常用的根癌农杆菌菌系及菌株 205

10.3.2根癌农杆菌的侵染能力的内在因素 205

10.3.3根癌农杆菌的侵染能力差异及植物的敏感反应 208

10.4根癌农杆菌的转化策略 210

10.4.1Ti质粒载体系统的选择 210

10.4.2利用野生型致瘤载体转化策略 213

10.4.3利用非致瘤载体的转化策略 216

10.5根癌农杆菌转化程序及操作原理 217

10.5.2根癌农杆菌的培养、纯化、保存及工程菌液的制备 218

10.5.1根癌农杆菌Ti质粒的转化基本程序 218

10.5.3Vir区基因活化诱导物的使用 220

10.5.4外植体的选择 221

10.5.5外植体的预培养、接种及与农杆菌的共培养 223

10.5.6外植体脱菌及选择培养 226

10.6根癌农杆菌Ti质粒转化的方法 228

10.6.1整体植株接种共感染法 228

10.6.2叶盘转化法 229

10.6.3原生质体共培养转化方法 231

10.7根癌农杆菌转化系统的评述 232

第十一章 发根农杆菌Ri质粒载体基因转化 237

11.1发根农杆菌的生物学特性 237

11.1.1发根农杆菌的宿主及转化体的特性 237

11.1.2发根农杆菌的分类及命名 238

11.1.3毛状根是单细胞克隆体 240

11.1.4发根农杆菌的冠瘿碱合成 240

11.2Ri质粒的基因结构与功能 240

11.2.1Ri质粒的酶切图谱 240

11.2.2Ri质粒基因结构及与Ti质粒的同源性 241

11.2.3Vir区的基因结构与功能 243

11.2.4Ri质粒T区的基因结构与功能 243

11.3发根农杆菌基因转化策略 246

11.3.1共整合载体转化 246

11.3.2双元载体转化 246

11.4发根农杆菌基因转化的方法及操作 247

11.4.1转化方法 247

11.5.1发根农杆菌的种类之间侵染能力的差异 248

11.5Ri质粒基因转化的影响因素 248

11.4.2毛状根的培养 248

11.5.2Vir区基因的影响 249

11.5.3发根农杆菌染色体基因的影响 249

11.5.4宿主本身的作用是发根农杆菌侵染的重要因素 249

11.6Ri质粒T-DNA在转化体中的遗传特性 250

11.6.1转化体的遗传稳定性 250

11.6.2T-DNA在受体细胞的整合特性 250

11.7发根农杆菌转化的应用 251

11.7.1促进生根 251

11.7.2增强抗逆性 251

11.7.3次生代谢产物生产 251

11.7.4农杆菌与植物之间的进化关系 251

12.1.1植物病毒的种类及其基因组 254

12.1植物病毒的生物学特性 254

第十二章 植物病毒载体介导基因转化 254

12.1.2植物病毒的形态结构及化学组成 256

12.1.3植物病毒的侵染机理 257

12.1.4病毒的装配 258

12.2双链DNA病毒转化载体 259

12.2.1CaMV的形态结构及其特性 259

12.2.2CaMV的分子结构 260

12.2.3CaMV的基因及其功能 262

12.2.4CaMV的转录体 262

12.2.5CaMVDNA的复制 263

12.2.6CaMV基因组的突变、删除、插入 264

12.2.7CaMV作为植物基因工程载体的探索 266

12.3.1双联体病毒的生物学特性 267

12.3植物单链DNA病毒转化载体 267

12.3.2GeNV的基因组结构 268

12.4植物单链RNA病毒的基因转化载体 271

12.4.1单链RNA病毒的特性 271

12.4.2RNA病毒的复制和表达 271

12.4.3RNA病毒作为基因转化载体的探索 272

12.5反转录病毒基因转化载体 273

12.5.1反转录病毒的分子生物学特点 273

12.5.2反转录病毒载体构建的一般原理及方法 275

12.5.3反转录病毒转化载体的类型 275

12.5.4反转录病毒载体存在的问题 276

12.6植物病毒作为基因转化载体的应用潜力和策略 276

12.6.3病毒载体与质粒载体的比较及应用潜力 277

12.6.2病毒载体系统的选择策略 277

12.6.1病毒载体系统的基本条件 277

第十三章 DNA直接导入基因转化及原理 281

13.1化学诱导DNA直接转化 281

13.1.1PEG介导基因转化 281

13.1.2脂质体介导基因转化 284

13.2物理法诱导DNA直接转化 286

13.2.1电激法介导基因转化 286

13.2.2超声波介导基因转化 289

13.2.3显微注射介导基因转化 291

13.2.4激光微束介导基因转化 292

13.2.5基因枪法介导基因转化 295

第十四章 种质系统介导基因转化 304

14.1花粉管通道法介导基因转化 304

14.1.1花粉管导入的原理 305

14.1.2花粉管导入的分子验证及实验证据 309

14.1.3花粉管通道法的操作程序 311

14.1.4对花粉管通道法的技术评价 312

14.2生殖细胞浸泡法介导基因转化 313

14.2.1浸泡转化法的原理 313

14.2.2浸泡转化法的程序 315

14.2.3浸泡转化法的技术评价 315

14.3胚囊、子房注射法介导基因转化 315

14.3.1胚囊、子房注射法的原理 316

14.3.2胚囊、子房注射法的操作程序 316

14.3.3胚囊、子房注射法的初步证据 317

15.1.2基因转化系统的评价条件 319

15.1.1基因转化系统的概念 319

15.1植物基因转化系统的分析 319

第十五章 植物基因转化系统的选择策略及单子叶植物基因转化 319

15.1.3植物基因转化系统总汇 320

15.1.4各种转化系统的比较 321

15.2植物基因转化系统的选择原则 322

15.3单子叶植物的基因转化 323

15.3.1农杆菌介导单子叶植物基因转化 323

15.3.2DNA直接导入法对单子叶植物的基因转化 329

15.3.3种质系统导入法对单子叶植物的基因转化 332

15.3.4单子叶植物转化使用的选择标记及报告基因 332

第三篇 外源基因的表达、检测及遗传特性 335

第十六章 转化外源基因在植物细胞中的表达调控 335

16.1高等植物基因表达调控机理 335

16.1.1高等植物基因的分子结构特点 336

16.1.3顺式作用元件的转录调控 338

16.1.2高等植物基因表达调控系统的特点 338

16.1.4反式作用因子的调控 340

16.1.5高等植物基因表达的转录后调控 342

16.2转化外源基因的瞬时表达和稳定表达 342

16.2.1转化外源基因的瞬时表达 342

16.2.2转化外源基因的稳定表达 345

16.2.3转化外源基因的同源性和异源性表达 345

16.3DNA序列对转化外源基因的表达调控 347

16.3.1植物基因工程中常用的启动子及其对转录的调控作用 347

16.3.2终止子的转录调控作用 353

16.3.35′,3′端序列对外源基因转录后的调控作用 353

16.3.4内含子对转化外源基因的表达调控作用 356

16.3.5信号肽序列对转化外源基因翻译产物的调控作用 357

16.4DNA甲基化对转化外源基因表达的调控作用 358

16.4.1DNA甲基化的作用机制 359

16.4.2DNA甲基化在转基因植物中的作用 359

16.4.3后成修饰与转基因的失活 359

16.5激素对转化外源基因表达的调控作用 360

16.5.1细胞分裂素对转化外源基因的表达调控 360

16.5.2生长素对转化外源基因的表达调控 361

16.5.3GA对转化外源基因的表达调控 362

16.5.4乙烯对转化外源基因的表达调控 363

16.5.5脱落酸对转化外源基因的表达调控 364

16.6提高转化外源基因表达的策略 364

16.6.1克服转化外源基因失活的策略 364

16.6.2增强子的正确利用 365

16.6.3构建高效表达的转化载体 365

16.6.4优化先导序列、提高翻译效率 366

第十七章 外源基因整合的鉴定 368

17.1分子杂交概述 368

17.2Southern杂交 369

17.2.1植物总DNA提取 370

17.2.2杂交探针的制备 376

17.2.3Southern斑点杂交 398

17.2.4Southern印迹杂交 398

17.2.5Southern原位杂交 417

17.3PCR-Southern杂交检测 418

17.3.1PCR技术概述 418

17.3.2转基因植株PCR-Southern杂交检测 423

17.4外源基因整合的RFLP及RAPD分析 425

17.4.1RFLP分析原理 425

17.4.2RAPD分析原理 426

第十八章 外源基因表达的检测 428

18.1报告基因的酶法检测 428

18.1.1Gus基因的检测 428

18.1.2Cat基因的检测 432

18.1.3冠瘿碱合成酶基因的检测 435

18.1.4荧光素酶基因的检测 436

18.1.5Npt-Ⅱ基因的检测 437

18.1.6Pat基因的检测 439

18.1.7DHFR基因的检测 439

18.2外源基因转录的检测 440

18.2.1Northern杂交 440

18.2.2RT-PCR检测 447

18.3外源基因表达蛋白的检测 448

18.3.1ELISA检测 448

18.3.2Westhern杂交 452

18.3.3表达蛋白的含量测定 457

第十九章 转基因植物的遗传特性 460

19.1转基因植物中外源DNA的整合位点和拷贝数 460

19.1.1整合位点 460

19.1.2整合拷贝数 462

19.1.3转基因植物中整合基因的重排及结构变化 462

19.2转基因植物中外源DNA整合的遗传效应 463

19.2.1外源DNA整合的位置效应 463

19.2.2同源基因的共抑制效应 464

19.2.3外源基因的重排效应 466

19.3转化外源基因的稳定性 466

19.3.1外源基因在转化细胞培养中的稳定性 466

19.3.2外源基因在遗传传递中的稳定性 467

19.3.3转基因植株的倍性变化 468

19.4外源基因在转化植株中的遗传传递规律 468

19.4.1单位点插入外源基因的遗传传递规律 469

19.4.2多位点插入外源基因的遗传传递规律 470

19.5转化方法对整合外源基因结构及遗传特性的影响 470

19.5.1转化方法对外源DNA结构的影响 470

19.5.2转化方法对外源基因遗传稳定性的影响 473

19.5.3不同转化方法的遗传特性比较 474

第二十章 植物基因工程存在的问题及新策略 477

20.1植物基因工程的研究进展 477

20.2植物基因工程存在的技术问题 477

20.2.1提高基因转化率 477

20.3植物基因工程潜在的应用问题 478

20.2.4提高转化外源基因的遗传稳定性 478

20.2.2建立高频再生的基因转化受体系统 478

20.2.3提高对转化外源基因表达的调控能力 478

20.3.1植物基因工程与常规育种的关系 479

20.3.2植物基因工程与农业资源遗传多样性保护 479

20.3.3植物基因工程与病虫抗药性 479

20.3.4植物基因工程与环境生态平衡 480

20.4植物基因转化的新策略 481

20.4.1反义RNA的基因操作 481

20.4.2核酶基因操作 484

20.4.3无毒信号基因介导广谱抗病新策略 487

20.4.4转座子载体系统介导的基因转化策略 490

20.5.1产物已知的基因克隆策略 494

20.5.2产物未知的基因克隆策略 494

20.5植物目的基因克隆新策略 494

20.5.3核DNA减法克隆基因新策略 498

20.5.4mRNA差异显示法基因克隆新策略 501

20.6展望 503

第四篇 植物基因工程实验技术 506

第一部分 目的基因克隆及载体构建 506

实验1-1大肠杆菌质粒DNA提取 506

实验1-2大肠杆菌质粒DNA纯化 509

实验1-3农杆菌Ti质粒DNA提取 514

实验1-4农杆菌双元载体中Mini-Ti质粒DNA提取 517

实验1-5Ml3噬菌体DNA的提取 518

实验1-6大肠杆菌染色体DNA提取 519

实验1-7cDNA合成及cDNA文库构建 520

实验1-8目的基因的PCR扩增 524

实验1-9mRNA差别显示（DDRT-PCR） 525

实验1-10DNA序列测定 527

实验1-11目的基因与载体的限制性酶切及连接 532

实验1-12质粒DNA转化大肠杆菌 537

实验1-13菌落原位杂交 538

实验1-14重组DNA质粒的快速抽提检测 539

实验1-15根癌农杆菌Ti质粒的接合转移 541

实验1-16抗生素抗性标记基因引入Ti质粒 544

实验1-17中间载体的构建 544

实验1-18三亲交配法将中间载体质粒导入农杆菌 546

实验1-19DNA直接导入农杆菌 547

实验1-20中间表达载体构建 549

第二部分 目的基因的转化 550

实验2-1根癌农杆菌整体植株及离体器官接种诱发冠瘿瘤 550

实验2-3农杆菌叶盘法转化 552

实验2-2冠瘿瘤的离体培养及植株再生 552

实验2-4悬浮细胞与农杆菌共培养转化 555

实验2-5原生质体与农杆菌共培养转化 556

实验2-6发根农杆菌整体植株接种及离体器官共培养诱导毛状根 558

实验2-7毛状根的离体培养及植株再生 558

实验2-8发根农杆菌介导的目的基因转化 560

实验2-9病毒介导外源基因转化 560

实验2-10基因枪转化外源基因 562

实验2-11PEG介导基因转化 564

实验2-12电激诱导基因转化 565

实验2-13显微注射导入外源基因 566

实验2-14激光转化外源基因 568

实验2-15超声波转化外源基因 569

实验2-16脂质体转化外源基因 571

实验2-17花粉粒媒体介导外源基因转化 574

实验2-18子房注射导入外源基因 576

实验2-19穗鞘腔浸泡导入外源基因 576

实验2-20种子浸泡导入外源基因 576

第三部分 转基因植物的检测技术 578

实验3-1冠瘿碱检测 578

实验3-2Npt-Ⅱ活性检测 580

实验3-3Gus活性检测 585

实验3-4Cat活性检测 590

实验3-5PAT活性检测 593

实验3-6DHFR活性检测 594

实验3-7荧光素酶活性检测 595

实验3-8植物总核酸提取 597

实验3-9植物总DNA提取 598

实验3-10植物核DNA提取 602

实验3-11植物细胞器DNA提取 605

实验3-12植物总RNA提取 608

实验3-13总RNA中mRNA的分离 610

实验3-14核酸提取物纯度及浓度检测 611

实验3-15转基因植物的Southern杂交鉴定 614

实验3-16外源基因整合的PCR检测 624

实验3-17外源基因整合的PCR-Southern杂交检测 625

实验3-18外源基因整合的原位杂交 625

实验3-19外源基因表达的Northern杂交检测 627

实验3-20外源基因表达的RT-PCR检测 630

实验3-21外源基因表达的ELISA检测 631

实验3-22外源基因表达的Western印迹分析 634

附录 638