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第1章 流式细胞仪基本结构与原理 1

1.1 流式细胞仪基本结构与功能 1

1.1.1 流式细胞仪基本结构 1

1.1.2 流式细胞仪的基本功能与应用 4

1.2　流式细胞术的重要术语 4

1.2.1 前向散射与侧向散射 4

1.2.2　Coulter效应与电子体积 6

1.2.3　荧光信号及其面积与宽度 6

1.2.4 光谱重叠与荧光补偿 7

1.2.5　细胞基础荧光域值与阴性对照置信区间 9

1.3 流式细胞术基本原理 11

1.3.1　流式细胞术分析的基本原理 11

1.3.2 流式细胞术分选的基本原理 13

1.3.3 流式细胞仪荧光补偿设置 14

1.4 流式细胞术的样本设置 15

1.4.1　常用对照 15

1.1.2　一套完整的流式细胞术检测样本设置 16

1.5　流式细胞术的数据分析 16

1.5.1　数据显示与分析 17

1.5.2　设门 20

1.5.3 数据分析中几种常见图形及分析原则 23

第2章 抗原抗体反应基本特点与流式抗体及荧光染料的选择 27

2.1　抗原抗体反应基本特点 27

2.1.1　抗原抗体结合具有特异性 27

2.1.2　抗原与抗体的结合是可逆的化学反应 27

2.2　抗原抗体反应影响因素 27

2.2.1 电解质 27

2.2.2　反应温度与时间 27

2.2.3　pH值 28

2.3　流式抗体的选择 28

2.3.1 尽量使用直标抗体 28

2.3.2　注意流式抗体的应用级别 28

2.3.3　抗体滴度或标记量的选择 28

2.3.4　根据流式细胞仪的类型及荧光素的荧光光谱选择荧光抗体 28

2.3.5　根据检测物（抗原）表达量选择荧光染料 29

2.4　荧光染料特性及其应用 30

2.4.1　抗体标记荧光染料特性及其应用 30

2.4.2　核酸荧光染料的特性及其应用 30

2.4.3 细胞膜及其他荧光探针的特性及其应用 33

第3章　细胞表面分子的检测与分析 36

3.1 流式细胞术在细胞表面分子的检测与分析中的应用 36

3.1.1　免疫细胞及其亚群的检测与功能分析 36

3.1.2 血液系统细胞表面标志的研究 36

3.1.3　细胞群体及细胞表面标志变化的监测 36

3.1.4　细胞表面标志构成性质的分析 36

3.2　标本制备 36

3.2.1 血液或骨髓标本的制备 36

3.2.2 体液、灌洗液或悬浮培养细胞的制备 36

3.2.3　贴壁细胞的制备 37

3.2.4　组织标本的制备 37

3.3　细胞表面分子免疫标记方法 37

3.3.1　直接免疫荧光法 37

3.3.2　间接免疫荧光法 38

3.3.3　全血直接标记法 39

3.3.4 直接与间接免疫荧光混合染色法 40

3.4　常用的免疫细胞表面标志的检测与分析 40

3.4.1 T淋巴细胞及其亚类检测 41

3.4.2 B淋巴细胞及其亚类检测 47

3.4.3 NK细胞与NKT细胞检测 47

第4章 细胞内或细胞核内抗原检测与分析 49

4.1 流式细胞术分析细胞内或细胞核内抗原基本步骤 49

4.1.1 细胞固定剂和穿膜剂的选择 49

4.1.2 最佳抗体浓度的选择 51

4.1.3　细胞膜内外FcR的封闭 51

4.2　胞内抗原的检测与分析——胞内细胞因子的检测与分析 51

4.3 核内抗原的检测与分析——调节性T细胞（Treg,CD4+CD25+Foxp3+）的检测与分析 56

第5章　细胞凋亡的检测与分析 60

5.1　样品来源与收集 60

5.2　PI单染法——亚“G1”峰检测法 61

5.3 Annexin-V-PI复染法 63

5.4　末端转移酶标记技术（TUNEL） 65

5.5 细胞周期特异性细胞凋亡的检测（PI-Annexin-V,PA法） 66

第6章 DNA含量检测与细胞周期的分析 69

6.1 常用DNA和RNA染料 70

6.2　DNA倍体分析在肿瘤诊断和治疗中的意义 72

6.2.1 DNA倍体分析的判定标准 72

6.2.2 DNA倍体分析在肿瘤诊断和治疗中的意义 73

6.3 细胞DNA检测的内参考标准 74

6.3.1　鸡红细胞 74

6.3.2　人淋巴细胞 74

6.3.3　鳖红细胞 75

6.4 DNA样品的制备和检测 75

6.4.1 DNA样品的制备和检测的影响因素与注意事项 75

6.4.2 培养细胞或悬浮样品的DNA含量检测 76

6.4.3 新鲜组织细胞核的DNA含量检测 77

6.4.4 石蜡包埋组织块切片的DNA含量检测 78

6.4.5　FCM在肿瘤脱落细胞学检查的应用 78

6.5　数据采集后的软件分析 79

6.5.1 运用ModFit LT进行自动分析 80

6.5.2　运用ModFit LT进行手动分析 80

6.5.3　运用ModFit进行同步化分析 81

6.5.4 运用ModFit LT进行增殖分析 82

6.6　药物对细胞周期的影响 82

6.7　流式细胞核型分析 83

6.8 FCM-DNA检测的质量控制 85

6.8.1　标本采集和固定方法的质控 85

6.8.2　单细胞悬液制备的质控制备 85

6.8.3　石蜡包埋组织单细胞悬液制备的质控 85

6.8.4　脱落细胞样品的采集 86

6.8.5 细胞悬液荧光染色的质控 86

6.8.6　流式细胞仪器操作技术质控 86

6.8.7　流式细胞分析资料处理的质控 86

6.8.8　定量荧光细胞染色技术的评价标准 86

第7章 细胞增殖的检测与分析 87

7.1 以检测细胞增殖抗原标志物为基础的分析法 87

7.1.1 BrdU/DNA双参数法 87

7.1.2 Ki-67检测与分析 88

7.1.3 PCNA/DNA双参数法 89

7.1.4 Cyclins/DNA双参数法 90

7.2　以检测细胞分裂情况为基础的分析法 92

7.2.1　检测细胞增殖的常用荧光染料及其分析原理 92

7.2.2 以检测细胞分裂情况为基础的分析法的应用 93

第8章　细胞毒的检测与分析 98

8.1　体外细胞毒检测方法 98

8.1.1 CFSE/PI或PKH-67/PI检测法 98

8.1.2 GFP/PI检测法——以NK杀伤活性为例 100

8.2 体内CTL细胞毒检测方法——CFSE标记法 101

第9章 可溶性蛋白质分子的检测与分析 103

9.1 可溶性蛋白质分子的定性、定量检测与分析 103

9.2 可溶性蛋白质分子的定量检测与分析——液相芯片技术（LabMAPTM和CBA技术） 104

9.2.1　液相芯片技术的基本原理 104

9.2.2　液相芯片的技术优势 104

9.2.3　液相芯片的主要实验步骤 105

9.2.4 LabMAPTM技术 105

9.2.5 BD微球阵列分析技术（CBA技术） 105

第10章　报告基因的检测和分析 109

10.1　报告基因GFP及其突变体 109

10.2　报告基因GFP及其突变体在生物学中的应用 110

10.2.1　筛选新的药物 110

10.2.2　发育分子机理研究 110

10.2.3 细胞筛选或分选标记物 110

10.2.4 基因产物功能及基因定位研究 110

10.2.5 细胞功能活动的动态观察 110

10.2.6　细胞、分子之间的相互作用研究 110

10.2.7　体内示踪与应用 110

10.2.8　在RNA 干扰与核酶体研究中的应用 110

10.2.9　免疫反应示踪标志物 111

10.2.10　在细胞凋亡相关基因研究中的应用 111

10.3　报告基因（GFP）的检测与分析 111

10.3.1　报告基因转染效率和（或）GFP融合蛋白表达的检测与分析 111

10.3.2 GFP融合基因的细胞周期检测与分析——GFP/PI双标记法 111

10.3.3 在细胞凋亡相关基因研究中的应用——GFP/Annexin-V/PI三色标记法 112

第11章 其他流式细胞术应用技术 115

11.1 胞内活性氧水平的检测与分析 115

11.1.1 DCFH-DA单染色法 115

11.1.2 DCFH/PI染色法 117

11.1.3 双氢罗丹明（Rhodamine）123染色法 117

11.2　细胞膜电位的检测与分析 119

11.2.1　检测细胞膜电位的染料及其检测原理 119

11.2.2　Cyanine（花青苷）染色法 120

11.2.3　罗丹明123染色法 120

11.2.4　JC-I染色法 120

11.3　细胞内钙离子浓度的检测与分析 122

11.3.1　检测细胞内钙离子浓度的荧光探针与检测原理 122

11.3.2　细胞内钙离子浓度的检测与分析——Fluo-3/AM染色法 124

11.4　荧光共振能量转移技术及应用 125

11.5 干细胞（SP）的检测——Hoechst33342法 128

第12章 流式细胞仪的发展和商品化仪器 130

12.1　流式细胞仪的发展历史和趋势 130

12.1.1　专业化的流式细胞仪纷纷面世 131

12.1.2　仪器全面自动化 132

12.1.3 多色多参数分析迅速发展 132

12.2　流式细胞仪商品仪器概述 133

12.2.1 激发光源及其荧光染料 133

12.2.2　液流系统 137

12.2.3　信号检测和光电转换 138

12.2.4　分选系统 140

12.2.5　数据处理与分析 141

12.2.6　流式微球芯片 142

12.2.7　图像流式细胞仪 143

12.3　流式细胞仪的主要技术指标 144

12.3.1　荧光分辨率 144

12.3.2　荧光灵敏度 144

12.3.3　前向角散射光灵敏度 145

12.3.4　前向角散射光分辨率 145

12.3.5　分析速度 145

12.3.6　分选指标 145

附录1 常见流式细胞术及荧光显微镜荧光染料激发波长与发射波长快查表 146

附录2 149

2.1　常用溶液的配制 149

2.2 Hanks液的配制 149

2.3 磷酸盐缓冲液（PB）的配制 150

参考文献 153