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1 绪论——基因工程概况 1

1.1 引言 1

1.1.1 基因工程含义 1

1.1.2 基因工程理论依据 1

1.1.3 基因工程研究的基本技术路线 3

1.1.4 基因工程研究发展史 3

1.2 基因工程研究内容 4

1.2.1 基础研究 4

1.2.2 应用研究 8

1.3 基因工程的安全性问题 14

1.4 基因工程研究发展前景 15

2 DNA重组 16

2.1 DNA的组成和结构 16

2.1.1 DNA的组成 16

2.1.2 DNA的空间结构 17

2.1.3 DNA复制起始位点和复制子的结构 20

2.1.4 DNA转录启动子和转录区的结构 22

2.2 天然DNA的制备 25

2.2.1 天然DNA的来源和用度 25

2.2.2 天然DNA的提取 26

2.2.3 DNA的纯化 30

2.2.4 DNA的浓缩 33

2.3.1 限制性核酸内切酶 34

2.3 限制性核酸内切酶和DNA片段化 34

2.3.2 限制性核酸内切酶作用机制 35

2.3.3 限制性核酸内切酶的识别序列 36

2.3.4 限制性核酸内切酶切割DNA的位点 39

2.3.5 限制性核酸内切酶反应系统 41

2.3.6 限制性核酸内切酶的Star活性 46

2.3.7 DNA分子片段化 47

2.3.8 DNA分子的限制性图谱 49

2.4 特异性DNA片段的PCR扩增 54

2.4.1 PCR基本原理 54

2.4.2 PCR扩增特异性DNA片段的主要条件 56

2.4.3 PCR扩增DNA片段的方法 59

2.4.4 常用的DNA片段PCR扩增系统 60

2.5 DNA片段的化学合成 60

2.5.1 寡核苷酸片段的化学合成的方法 60

2.5.2 化学方法合成的DNA片段 66

2.6 DNA片段大小的凝胶电泳检测 68

2.6.1 琼脂糖凝胶电泳参数 69

2.6.2 DNA片段(分子)大小的估算 71

2.6.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳参数 73

2.6.4 脉冲场凝胶电泳(CHFE)参数 74

2.7 DNA片段的连接重组 76

2.7.1 DNA连接酶 76

2.7.2 DNA片段之间的连接 77

2.7.3 DNA重组类型 83

3 基因克隆载体 85

3.1 质粒克隆载体 86

3.1.1 与构建克隆载体相关的质粒性质 86

3.1.2 构建质粒克隆载体的基本策略 89

3.1.3 质粒克隆载体的构建 90

3.2 病毒(噬菌体)克隆载体 104

3.2.1 λ噬菌体克隆载体 106

3.2.2 cosmid克隆载体 112

3.2.3 M13噬菌体克隆载体 115

3.2.4 CaMV克隆载体 118

3.2.5 烟草花叶病毒(TMV)克隆载体 123

3.2.6 SV40克隆载体 124

3.2.7 反转录病毒克隆载体 127

3.2.8 腺病毒克隆载体 131

3.2.9 痘苗病毒克隆载体 136

3.2.10 杆状病毒表达克隆载体 138

3.3 染色体定位整合克隆载体 138

3.3.1 定位整合克隆载体的几种模式 139

3.3.2 定位整合克隆载体的定位整合效率 141

3.3.3 定位整合克隆载体 142

3.4 人工染色体克隆载体 146

3.4.1 人工染色体克隆载体含义和特点 146

3.4.2 人工染色体克隆载体的构建 147

3.4.3 人工染色体克隆载体的应用 148

3.5.1 启动子探针型克隆载体 149

3.5 特殊用途克隆载体 149

3.5.2 诱导型表达克隆载体 150

3.5.3 反义表达克隆载体 152

3.5.4 组织特异性表达克隆载体 153

3.5.5 分泌型表达克隆载体 156

3.5.6 双启动子表达克隆载体 156

3.5.7 串联启动子表达克隆载体 157

3.5.8 含增强子表达克隆载体 158

4.1 目的基因 159

4.1.1 结构基因组成 159

4 目的基因的制备 159

4.1.2 基因的排列 162

4.2 目的基因的制备 164

4.2.1 直接分离法 164

4.2.2 构建基因组文库分离法 166

4.2.3 cDNA基因文库的构建及目的基因分离 178

4.2.4 利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因 195

4.2.5 基因的化学合成 204

4.3 目的基因的分离 207

4.3.1 目的基因的功能克隆 207

4.3.2 序列克隆法 210

4.3.3 筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技片 215

4.3.4 利用差示分析法分离目的基因克隆 221

4.3.5 功能结合法筛选目的基因 235

4.3.6 DNA插入诱变法分离目的基因 237

4.3.7 应用基因定位克隆技术分离筛选目的基因 240

4.3.8 基因的定位候选克隆法 248

4.3.9 染色体显微切割与微克隆法 249

4.3.10 根据生物大分子间的相互作用分离目的cDNA克隆 251

5 目的基因导入受体细胞 257

5.1 受体细胞 257

5.1.1 原核生物细胞 258

5.1.2 真菌细胞 259

5.1.4 动物细胞 260

5.1.3 植物细胞 260

5.2 重组DNA分子转入原核生物细胞 261

5.2.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 261

5.2.2 重组λ噬菌体DNA分子转导大肠杆菌 269

5.2.3 受体细胞的选择 271

5.2.4 重组DNA分子转入真核细胞 274

5.3 重组子的筛选 285

5.3.1 遗传表型直接筛选法 286

5.3.2 依赖于重组子结构特征分析的筛选法 296

5.3.3 核酸分子杂交检测法 297

5.3.4 免疫化学检测法 313

5.3.5 转译筛选法 317

5.3.6 亚克隆法 318

5.3.7 插入失活法 319

5.3.8 电子显微镜作图检测法 321

5.3.9 转录产物作图 322

5.3.10 基因表达产物分析法 324

5.3.11 DNA序列测定法 326

6 外源基因的表达 342

6.1 基因表达的机制 342

6.1.1 外源基因的起始转录 342

6.1.2 mRNA的延伸与稳定性 342

6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译 343

6.1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性 344

6.1.5 目的基因沉默 345

6.2 基因表达的调控元件 346

6.2.1 启动子 346

6.2.2 增强子 352

6.2.3 终止子 353

6.2.4 衰减子 354

6.2.5 绝缘子 354

6.2.6 反义子 355

6.3 外源基因表达系统 355

6.3.1 大肠杆菌基因表达系统 356

6.3.2 芽孢杆菌表达系统 364

6.3.3 链霉菌表达系统 367

6.3.4 蓝藻表达系统 371

6.3.5 酵母表达系统 374

6.3.6 哺乳动物细胞基因表达系统 378

6.3.7 植物细胞基因表达系统 385

6.4 基因表达产物的检测与分离纯化 389

6.4.1 基因表达产物的检测 389

6.4.2 基因表达产物的分离纯化 394

7 基因工程应用 399

7.1 基因工程药物 399

7.1.1 基因工程激素类药物 399

7.1.2 基因工程细胞因子类药物 400

7.1.3 基因工程抗体 403

7.1.4 基因工程受体 404

7.1.5 基因工程疫苗 405

7.2 转基因植物 408

7.2.1 抗病虫害转基因植物 408

7.2.2 抗逆转基因植物 413

7.2.3 药用转基因植物 414

7.2.4 转基因植物食品 415

7.2.5 其他转基因植物 417

7.3 转基因动物 418

7.3.1 利用转基因动物改良动物品种 418

7.3.2 转基因动物作为生物反应器 419

7.3.3 转基因动物筛选药物 420

7.3.4 转基因动物应用于人体器官移植 422

7.4 基因治疗 423

7.4.1 肿瘤的基因治疗 424

7.4.2 分子遗传病的基因治疗 430

7.4.3 心血管病的基因治疗 433

7.4.4 艾滋病的基因治疗 435

7.5 基因芯片 437

7.5.1 基因芯片原理及技术 437

7.5.2 基因芯片的应用 440

8 基因工程的争论和安全措施 443

8.1 对基因工程的争论 444

8.2 生物安全的争论带来的全球关注和影响 449

8.3 基因工程安全措施 451

8.4 我国的生物技术发展及其安全问题 455

附录 461

2-1 限制性核酸内切酶酶族的识别序列和切割位点(一) 461

2-2 识别序列甲基化对限制性核酸内切酶切割活性的影响 463

2-3 无磷酸化的寡核苷酸连杆 473

2-4 部分MCS连杆 475

3-1 λDNA上的限制性核酸内切酶识别位点 477

8-1 1993年12月24日中华人民共和国国家科学技术委员会第17号令发布的《基因工程安全管理办法》 479

8-2 我国1997年颁布的《农业生物基因工程安全管理实施办法》 485

8-3 我国2001年6月6日颁布的《农业转基因生物安全管理条例》 506

参考文献 517