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着手一个噬菌体展示项目 12

实验方案1.1 滴定及增殖噬菌斑纯化的丝状噬菌体 12

文库的构建和保存 25

实验方案2.1 dU-ssDNA模板的分离 25

实验方案2.2 噬菌体文库的构建 27

实验方案2.3 大肠杆菌的电转化和噬菌体的繁殖 29

实验方案2.4 噬菌体展示文库的再增殖 30

生物试剂 31

实验方案2.5 感受态大肠杆菌SS320的制备 31

实验方案2.6 制备辅助噬菌体储液 32

体外DNA重组的方法 36

实验方案3.1 DNA改组 36

实验方案3.2 DNA的随机片段化 37

实验方案3.3 随机引物重组 39

实验方案3.4 StEP DNA重组 40

实验方案3.5 异源双链重组：异源双链质粒 41

实验方案3.6 异源双链重组：异源双链插入片段 41

实验方案3.7 使用尿嘧啶DNA糖基化酶对含有尿嘧啶的DNA去污染 44

载体的考虑 50

实验方案4.1 用大肠杆菌XL1-blue菌株制备噬菌体 50

靶标的呈递 54

实验方案4.2 靶标的包被及噬菌体的结合 54

实验方案4.3 噬菌体结合的ELISA检测 56

筛选 58

实验方案4.4 噬菌体结合筛选、洗涤及洗脱 58

实验方案4.5 富集度的监测 59

分析前的鉴定 61

实验方案4.6 噬菌体克隆鉴定 61

噬菌体结合性检测的进行 68

实验方案5.1 靶标包被的微孔板的准备 68

实验方案5.2 固定化的包被试剂和加入的噬菌体的滴定 69

实验方案5.3 噬菌体结合性检测 70

构建pⅧ噬菌粒随机肽库 77

实验方案6.1 构建pⅧ噬菌粒库：载体的准备 77

实验方案6.2 构建pⅧ噬菌粒库：插入片段的准备 77

实验方案6.3 构建pⅧ噬菌粒库：连接插入片段与BstⅪ消化的p8V5载体 79

实验方案6.4 构建pⅧ噬菌粒库：扩增与储存 80

筛选pⅧ噬菌粒库 82

实验方案6.5 筛选pⅧ噬菌粒库：亲和筛选 82

实验方案6.6 筛选pⅧ噬菌粒库：所筛选噬菌体的扩增 82

鉴定所获取的克隆 83

实验方案6.7 筛选pⅧ噬菌粒库：通过噬菌体ELISA鉴定得到的噬菌体克隆 83

冠状二聚体库的亲和筛选 86

实验方案6.8 冠状二聚体系统展示的肽复合物的亲和筛选 86

底物筛选程序 93

实验方案7.1 底物噬菌体筛选 93

筛选出的序列的鉴定 98

实验方案7.2 AP融合蛋白的构建和测定 98

一般步骤及一个特例——从一个具有疏水性核心的突变体文库中筛选稳定的泛素变异体实验方案8.1 用循环PCR来组装双链的简并诱变寡核苷酸 105

实验方案8.2 黏末端定向的突变生成随机化文库 107

实验方案8.3 电转化和噬菌粒文库的储存，甘油保种的制备以及筛选所需的噬菌体的制备 108

实验方案8.4 用SPR对蛋白-噬菌体复合体单克隆的蛋白酶解的监测 112

实验方案8.5 使用Ni-NTA琼脂糖珠的基于蛋白酶的噬菌体文库筛选 114

噬菌体文库卡匣的构建 120

实验方案9.1 文库卡匣的构建 120

噬菌体载体的制备及文库的构建 122

实验方案9.2 噬菌体载体DNA的预处理及结合蛋白库的克隆 122

噬菌体的筛选 124

实验方案9.3 噬菌体DNA/RNA结合性筛选的标准程序 124

对筛选出的噬菌体克隆的分析 126

实验方案9.4 借助于噬菌体ELISA的DNA/RNA结合活性的分析 126

筛选过程 131

实验方案10.1 活体筛选 131

实验方案10.2 体外筛选 135

单个噬菌体的鉴定 138

实验方案10.3 插入区域的PCR扩增 138

实验方案10.4 PCR产物的测序 139

实验方案10.5 在石蜡包埋的组织上进行免疫组化 141

实验方案10.6 在新冷冻的组织上进行免疫荧光 142

实验方案10.7 荧光标记多肽的注射以及血管通过体内凝集素染色的显现 144

噬菌体文库的构建 148

实验方案11.1 构建基于pⅢ和pⅧ的天然表位文库（HCV基因组） 148

结合血清抗体的噬菌体展示肽的筛选 149

实验方案11.2 用于噬菌体感染的细菌细胞（TB细胞）的制备 149

实验方案11.3 UV灭活载体噬菌体的制备 149

实验方案11.4 用抗人抗体包被微珠 150

实验方案11.5 文库的筛选 151

实验方案11.6 扩增来自淘洗的噬菌体群落 152

筛选单个克隆 154

实验方案11.7 用于噬菌体展示文库的菌落试验 154

实验方案11.8 基于DNA的筛选 157

已选择克隆的鉴定 159

实验方案11.9 小规模制备噬菌体上清 159

实验方案11.10 用噬菌体上清和人血清进行ELISA 160

实验方案11.11 用人血清进行噬菌体ELISA 161

实验方案11.12 大量制备噬菌粒克隆 162

实验方案11.13 与噬菌体展示的多肽反应的血清抗体的亲和纯化 162

实验方案11.14 交叉抑制实验 163

实验方案11.15 PCR扩增的模板 164

表位成熟 166

实验方案11.16 表位成熟 166

在基于gⅥ的展示载体中克隆cDNA文库 173

实验方案12.1 从预制的λGT11文库中制备cDNA插入片段 173

实验方案12.2 大规模连接及纯化连接后的DNA 175

实验方案12.3 Top10F′细胞中的电转化及文库储存 176

gⅥ-cDNA融合噬菌体亲和选择 177

实验方案12.4 gⅥ-cDNA噬菌粒文库的获取和纯化 177

实验方案12.5 使用生物素抗原来选择gⅥ-cDNA噬菌体文库 179

实验方案12.6 用免疫亲和反应选择gⅥ-cDNA噬菌体文库 180

对选择出的克隆进行分析 181

实验方案12.7 gⅥ-cDNA噬菌粒文库小规模的获取和纯化 181

实验方案12.8 噬菌体ELISA 182

噬菌体抗体文库构建 195

实验方案13.1 从外周血淋巴细胞（PBLs）中分离RNA 195

实验方案13.2 cDNA第一链的合成 196

实验方案13.3 从cDNA第一链中扩增VH和VL基因 197

实验方案13.4 制备scFv接头DNA 199

实验方案13.5 用scFv接头PCR装配VH和VL进行scFv基因文库的构建 200

实验方案13.6 再扩增scFv基因文库以添加限制性位点进行克隆 201

实验方案13.7 对scFv基因文库及pHEN1噬菌体展示载体的限制性消化 201

实验方案13.8 scFv和载体DNA的连接 202

实验方案13.9 电感受态大肠杆菌TG1的制备 203

实验方案13.10 电转化连接物及构建抗体文库 204

制备用于抗原上选择的噬菌体抗体 206

实验方案13.11 自文库甘油储存料中制备噬菌体抗体 206

实验方案13.12 用氯化铯离心法纯化噬菌体 208

从噬菌体文库中选择抗原特异性抗体 210

实验方案13.13 在固相抗原上选择噬菌体抗体 210

实验方案13.14 用可溶性生物素化抗原进行选择 211

识别鉴定抗原结合性抗体 213

实验方案13.15 在微量滴定板中表达噬菌体抗体 213

实验方案13.16 噬菌体抗体ELISA 214

实验方案13.17 在微量滴定板中表达可溶性scFv 215

实验方案13.18 在微量滴定板中进行可溶性scFv ELISA 216

实验方案13.19 用PCR识别不同的噬菌体抗体克隆 217

在哪里又如何对抗体基因序列进行多样化 225

实验方案14.1 用突变的VLCDR3构建scFv基因文库 225

实验方案14.2 再扩增scFv VL CDR3基因文库添加3′限制性位点 226

实验方案14.3 连接scFv和载体DNA并转化大肠杆菌，构建scFv突变文库 227

实验方案14.4 VH CDR3基因文库和VL基因的扩增 228

实验方案14.5 PCR剪接VHCDR3基因文库和VL基因构建scFv基因文库 229

实验方案14.6 构建人VH基因节段文库 232

实验方案14.7 再扩增VH基因文库添加3′限制性位点并克隆创建VH基因节段文库 233

实验方案14.8 创建重链改组噬菌体文库 234

实验方案14.9 人VL基因文库的构建 236

实验方案14.10 创建轻链改组噬菌体文库 237

选择和筛选亲和力更高的抗体 238

实验方案14.11 平衡法选择高亲和力噬菌体抗体 238

筛选解离速率优化的scFv 240

实验方案14.12 用Biacore仪筛选解离速率较低的scFv 240

第1章 噬菌体生物学及噬菌体展示简介 1

1.1 简介 1

1.2 丝状噬菌体生物学 1

1.2.1 简介 1

1.2.2 噬菌体颗粒的结构 2

1.2.3 感染 4

1.2.4 复制 5

1.2.5 基因和基因表达 5

1.2.6 噬菌体装配生理学 6

1.2.7 噬菌体装配机制 7

1.3 噬菌体展示所使用的衣壳蛋白 8

1.3.1 pⅧ蛋白 8

1.3.2 pⅢ蛋白 8

1.4 着手一个噬菌体展示项目 9

1.4.1 展示的可行性 9

1.4.2 噬菌体载体还是噬菌粒载体？ 10

1.4.3 多价展示还是单价展示？ 10

1.4.4 辅助噬菌体 12

1.4.5 噬菌体制备及定量的一般实验方案 12

1.5 一个噬菌体展示项目的一般规则 14

1.5.1 一个文库的生成 14

1.5.2 筛选 15

1.5.3 克隆的分析 15

1.6 常见的问题 16

1.6.1 文库的质量 16

1.6.2 表达的编辑 16

1.6.3 过度筛选 17

1.7 作为替代的展示系统 17

1.8 噬菌体展示文库及试剂盒的商业来源 17

参考文献 18

第2章 使用寡核苷酸定向诱变构建噬菌体展示文库 21

2.1 简介 21

2.2 文库设计的考虑 21

2.2.1 点突变 21

2.2.2 简并密码子的设计 21

2.2.3 理论的和实际的多样性 22

2.3 定点诱变 22

2.3.1 定点诱变与盒式诱变的比较 22

2.3.2 寡核苷酸定向诱变的化学和生物学 23

2.3.3 无活性模板的构建 24

2.4 文库的构建和保存 24

2.4.1 单链DNA模板的制备 24

2.4.2 异源双链CCC-dsDNA的体外合成 26

2.4.3 大肠杆菌的电转化和文库噬菌体的制备 28

2.4.4 文库的保存和再感染 30

2.5 生物试剂 31

参考文献 32

第3章 体外DNA重组 34

3.1 导言 34

3.2 体外DNA重组的本底 34

3.2.1 体外DNA重组在定向进化中的使用 34

3.2.2 体外DNA重组的应用 35

3.2.3 重组统计学 35

3.3 体外DNA重组的方法 35

3.3.1 Stemmer法 35

3.3.2 来自大肠杆菌的内切核酸酶V的DNA的随机片段化 37

3.3.3 随机引物重组 38

3.3.4 交错延伸程序 38

3.3.5 体外异源双链的形成和体内修复（异源双链重组） 40

3.3.6 重组方法的选择 42

3.3.7 本底的消除 44

3.3.8 技术要点 45

参考文献 46

第4章 为提高蛋白及多肽的亲和性及特异性的噬菌体筛选策略 47

4.1 简介 47

4.2 载体的考虑 48

4.2.1 单价和多价噬菌体展示 48

4.2.2 确保展示的成功 49

4.2.3 通过噬菌粒载体的蛋白质表达 49

4.2.4 载体的构建及噬菌粒的制备 50

4.3 文库的设计 51

4.3.1 硬随机突变 52

4.3.2 软随机突变 52

4.4 靶标的呈递 53

4.4.1 直接固定 53

4.4.2 溶液中的结合 54

4.4.3 封闭 54

4.4.4 预筛选 54

4.5 筛选 56

4.5.1 结合缓冲液的考虑 56

4.5.2 选择压 56

4.5.3 竞争筛选 57

4.5.4 已结合的噬菌体的洗脱 57

4.5.5 扩增 59

4.5.6 筛选的监控 59

4.6 分析前的鉴定 61

4.7 DNA序列分析 61

4.7.1 测序的时机 61

4.7.2 序列的一致和同源 62

4.7.3 对一致性的评价 62

4.7.4 对噬菌体克隆的评价 63

4.8 疑难问题的排解 63

参考文献 64

第5章 用噬菌体ELISA快速鉴定噬菌体展示蛋白的结合亲和性 66

5.1 简介 66

5.2 噬菌体结合性检测的主导参数 66

5.3 噬菌体结合性检测的进行 68

5.3.1 噬菌体样本的制备 68

5.3.2 加入的噬菌体和固定化靶标的滴定 68

5.3.3 与靶标结合的噬菌粒的测定 70

5.3.4 置换曲线的拟合 71

5.4 结语 72

参考文献 72

第6章 使用重组肽库为受体识别新配体 73

6.1 简介 73

6.2 肽段展示系统简介 73

6.3 构建pⅧ噬菌粒随机肽库 75

6.4 筛选pⅧ噬菌粒库 81

6.5 鉴定所获取的克隆 83

6.6 先导肽的优化策略 84

6.7 用“冠状二聚体”系统构建次级库 85

6.8 冠状二聚体库的亲和筛选 86

6.9 转移到麦芽糖结合蛋白中分析 87

6.10 结论 88

参考文献 88

第7章 底物噬菌体展示 90

7.1 简介 90

7.2 底物文库的构建 91

7.2.1 相互结合位点的选择 92

7.2.2 底物卡匣（cassette）的设计和构建 92

7.3 底物筛选程序 93

7.4 筛选出的序列的鉴定 96

7.4.1 初始的序列分析 96

7.4.2 “表达编辑”以及其他潜在的复杂化因素 96

7.4.3 底物的详细鉴定 96

7.5 方法的延伸以及未来的方向 99

7.5.1 底物消减文库 100

7.5.2 肽段连接酶的底物特异性 100

7.5.3 蛋白激酶的底物特异性 100

7.5.4 用反转录病毒展示载体（retroviral display vector）进行的体内筛选 100

7.6 结论 101

参考文献 101

第8章 从噬菌体展示文库中对稳定折叠的蛋白质及蛋白质结构域进行的基于蛋白酶的筛选 102

8.1 简介 102

8.2 方法概述 102

8.3 一般步骤及一个特例——从一个具有疏水性核心的突变体文库中筛选稳定的泛素变异体 104

8.3.1 具有疏水性核心的突变体的噬菌粒文库的构建 105

8.3.2 噬菌粒文库的鉴定 110

8.3.3 稳定折叠的泛素变异体的蛋白酶筛选 110

8.4 噬菌体展示中基于蛋白酶的筛选的潜在新用途 115

参考文献 116

第9章 锌指结构与其他核酸结合性基序的噬菌体展示 117

9.1 简介 117

9.2 构建一个展示DNA结合性蛋白质的噬菌体文库的初步构想 117

9.2.1 噬菌体展示技术合适吗？ 117

9.2.2 了解蛋白质的DNA结合模式了吗？ 118

9.2.3 应该随机突变蛋白质的哪一个结构域？ 118

9.2.4 多价展示还是单价展示？ 119

9.2.5 蛋白质骨架与筛选策略的选择 119

9.3 噬菌体文库卡匣的构建 119

9.4 噬菌体载体的制备及文库的构建 122

9.5 噬菌体的筛选 124

9.6 对筛选出的噬菌体克隆的分析 126

致谢 127

参考文献 127

第10章 噬菌体展示文库在体内及体外的筛选 129

10.1 简介 129

10.2 体内及体外的噬菌体展示 129

10.3 噬菌体载体 130

10.4 体内及体外噬菌体展示对照的比较 130

10.5 筛选过程 130

10.6 单个噬菌体的鉴定 137

10.6.1 插入的编码区域的PCR和测序 138

10.6.2 单克隆与器官或组织的脉管系统特异性结合的建立 140

10.7 结语 145

致谢 145

参考文献 146

第11章 利用血清筛选噬菌体文库 147

11.1 介绍 147

11.2 噬菌体文库的构建 147

11.2.1 随机肽文库 147

11.2.2 天然表位文库 148

11.3 结合血清抗体的噬菌体展示肽的选择 153

11.4 选择策略 153

11.4.1 序贯选择 153

11.4.2 平行选择 153

11.5 筛选单个克隆 154

11.5.1 免疫筛选 154

11.5.2 基于DNA的筛选 156

11.6 已选择克隆的鉴定 159

11.6.1 ELISA 159

11.6.2 通过亲和纯化鉴定结合特异性 161

11.6.3 交叉抑制实验 161

11.6.4 DNA测序 164

11.7 表位成熟 165

致谢 168

参考文献 168

第12章 使用展示在噬菌体上的cDNA文库进行相互作用克隆 170

12.1 概述 170

12.2 用于噬菌体cDNA文库展示的载体 170

12.2.1 丝状噬菌体 170

12.2.2 溶解性噬菌体（lytic bacteriophage） 171

12.3 在基于gⅥ的展示载体中克隆cDNA文库 171

12.3.1 pG6质粒简介 171

12.3.2 利用PCR从预制的λGT11文库中制备cDNA插入片段 172

12.3.3 连接与转化 174

12.3.4 gⅥ-cDNA文库的评价及保存 177

12.4 gⅥ-cDNA融合噬菌体亲和选择 177

12.4.1 噬菌体文库的获取和纯化 177

12.4.2 生物素化的诱饵的制备 178

12.4.3 用生物素化的诱饵的淘选过程 178

12.4.4 免疫亲和淘选过程 179

12.5 对选择出的克隆进行分析 181

12.5.1 噬菌体酶联免疫吸附反应 182

12.5.2 序列分析及所筛选的cDNA的全长克隆 183

12.6 应用 183

致谢 184

参考文献 184

第13章 噬菌体抗体文库 186

13.1 简介 186

13.2 噬菌体抗体文库构建 186

13.2.1 V区多样性的来源 187

13.2.2 天然V基因的来源 194

13.2.3 V基因文库的装配和克隆 197

13.3 制备用于抗原上选择的噬菌体抗体 205

13.4 从噬菌体文库中选择抗原特异性抗体 208

13.5 识别鉴定抗原结合性抗体 212

13.6 可溶性scFv片段的纯化 218

13.7 问题处理 218

参考文献 220

第14章 噬菌体抗体的亲和力成熟 222

14.1 简介 222

14.2 在哪里又如何对抗体基因序列进行多样化 222

14.2.1 通过位点导向突变进行CDR3多样化构建scFv文库 224

14.2.2 构建用于亲和力成熟的链改组文库 230

14.2.3 构建轻链改组文库 235

14.3 选择和筛选亲和力更高的抗体 237

14.4 筛选解离速率优化的scFv 240

参考文献 241

附录 普通供应商 243