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第1章 细胞培养 1

单元1.1 哺乳动物细胞培养的基本方法 2

基本方案单层细胞的胰酶消化和传代 2

备择方案悬浮培养的细胞传代 3

支持方案1人单层贴壁细胞的冻存 3

支持方案2悬浮细胞的冻存 4

支持方案3人细胞系的解冻与复苏 4

支持方案4用血细胞计数板和台盼蓝染色法测定细胞数目及活性 4

支持方案5细胞运输的准备 5

单元1.2 适于哺乳动物细胞的培养基 6

基本方案1制备含血清的培养基 6

基本方案2制备血清减量或无血清培养基 7

基本方案3 HAT选择培养基的制备 8

基本方案4转化细胞在软琼脂中的生长 9

支持方案1培养基中pH的调节 9

支持方案2抗生素在培养基中的应用 10

单元1.3 细胞培养的无菌技术 11

基本方案1无菌技术 11

基本方案2层流式超净台的使用 12

单元1.4 灭菌和过滤 13

基本方案1液体的高压灭菌 14

备择方案干燥物品的高压消毒 15

基本方案2干热灭菌和清除热原法 16

基本方案3消毒剂的应用：70％乙醇 16

溶液的过滤除菌 17

基本方案4真空过滤 17

基本方案5小体积非水溶性液体的正压过滤 18

单元1.5 确定和控制细胞培养的微生物污染 19

基本方案1细菌和真菌污染的检测 19

基本方案2直接培养法检测支原体污染 21

基本方案3应用抗生素控制微生物污染 23

单元1.6 酵母培养及培养基 24

培养基的制备 24

酵母培养的综合考虑 30

第2章 细胞的制备与分离 35

单元2.1 成纤维细胞培养的建立 36

基本方案 36

单元2.2 人淋巴细胞的制备和培养 40

基本方案1 通过高分子质量的蔗糖-泛影钠（Ficoll-Hypaque）梯度离心制备淋巴细胞 40

基本方案2从淋巴细胞群里制备单核／巨噬细胞和树突状细胞 42

基本方案3通过包被在磁珠表面的单克隆抗体分选T细胞和B细胞 42

单元2.3 人脐静脉内皮细胞的制备 44

基本方案 44

单元2.4 转染EB病毒产生永生的B细胞株 45

基本方案 45

单元2.5 激光捕获显微切割 46

基本方案从组织切片中分离一种纯的细胞群 47

支持方案苏木素和伊红染色组织的激光显微切割 49

第3章 亚细胞组分分离和细胞器分离 50

单元3.1 细胞组分分离概述 51

单元3.2 分离大鼠肝细胞质膜片层与浆膜结构域 59

基本方案1分离质膜片层 59

支持方案1检测碱性磷酸二酯酶Ⅰ的活性 61

基本方案2分离质膜结构域 63

支持方案2 K＋激活的对硝基苯酚磷酸酯酶活性测定实验 63

支持方案3 5′-核苷酸酶活性测定实验 64

支持方案4间接免疫荧光法检测与质膜片层相连的蛋白质 65

单元3.3 利用差速及密度梯度离心法从组织和细胞中分离Go1gi膜 66

基本方案1利用蔗糖密度筛从大鼠肝脏中快速分离Golgi膜 67

基本方案2将大鼠肝脏提取的轻线粒体组分悬浮于非连续的蔗糖梯度液中来分离Golgi膜 68

基本方案3将培养的细胞悬浮于非连续的蔗糖梯度液中来分离Golgi膜 69

基本方案4用自发形成梯度的IODIXANOL梯度液从肝细胞微粒体组分中分离Golgi膜 70

支持方案测定UDP-半乳糖半乳糖基转移酶 71

单元3.4 利用差速离心及密度梯度离心从组织及细胞中分离溶酶体 72

基本方案1使用自发形成梯度的PERCOLL梯度液从大鼠肝脏中分离溶酶体 72

基本方案2 利用自发形成梯度的PERCOLL梯度液从培养的人HL-60细胞中分离溶酶体 74

支持方案1酸性磷酸酶的测定 75

支持方案2 β-N-乙酰葡糖胺酶的测定 76

单元3.5 差速离心法从组织和细胞中分离线粒体 76

基本方案1用大鼠肝脏制备重线粒体组分 77

基本方案2牛心脏线粒体的大量制备 78

基本方案3用骨骼肌制备线粒体 79

基本方案4用培养的细胞制备线粒体 80

基本方案5用酵母菌（酿酒酵母）制备线粒体 80

单元3.6 密度梯度离心法纯化粗线粒体组分 81

基本方案1用连续蔗糖梯度液分离大鼠肝脏的线粒体组分 82

基本方案2用非连续PERCOLL梯度液从大鼠脑分离线粒体 83

基本方案3用自发形成梯度的PERCOLL梯度液分离线粒体组分 84

支持方案1线粒体的琥珀酸脱氢酶分析 84

支持方案2溶酶体的β-半乳糖苷酶分析 85

支持方案3过氧化物体的过氧化氢酶分析 86

单元3.7 用差速离心法和密度梯度离心法从组织和细胞中分离过氧化物体 86

基本方案1从大鼠肝脏分离轻线粒体组分 87

基本方案2 用预先形成的连续IODIXANOL梯度液分离大鼠肝脏轻线粒体组分中的过氧化物体 88

基本方案3用预先形成的连续NYCODENZ梯度液分离大鼠肝脏轻线粒体组分中的过氧化物体 89

基本方案4用预先形成的连续NYCODENZ梯度液从酵母原生质体分离过氧化物体 90

基本方案5用预先形成的连续NYCODENZ梯度液从培养细胞（HepG2）分离过氧化物体 91

支持方案内质网标志酶NADPH细胞色素c还原酶的分析 92

单元3.8 从哺乳动物组织中分离细胞核及核膜 93

基本方案1使用蔗糖密度筛从大鼠肝组织匀浆中分离细胞核 93

备择方案 使用IODIXANOL梯度液从动物或植物（麦芽）细胞中分离细胞核 94

基本方案2分离细胞核膜：高离子强度的方法 95

基本方案3分离细胞核膜：低离子强度的方法 96

支持方案1二苯胺检测DNA 97

支持方案2苔黑素测定RNA 97

支持方案3溴化乙锭测定RNA及DNA 98

单元3.9 酿酒酵母的亚细胞组分分离 99

基本方案1利用差速离心法分离原生质体组分 111

支持方案应用酶解酶制备酵母原生质体 113

基本方案2应用NYCODENZ进行平衡密度梯度组分分离 114

基本方案3在蔗糖分级梯度液中进行P13000膜的组分分离 116

基本方案4应用FICOLL分级梯度液分离完整的囊泡 118

基本方案5应用F1COLL分级梯度液分离完整的细胞核 120

基本方案6应用NYCODENZ分级梯度液分离乳糖诱导的线粒体 124

基本方案7用蔗糖分级梯度液分离油酸盐诱导的过氧化物酶体 127

基本方案8用蔗糖分级梯度液分离内质网 129

基本方案9用蔗糖分级梯度液从完整的酵母细胞中分离质膜 131

基本方案10从完整的酵母细胞中分离细胞溶胶 132

第4章 细胞生物学研究的工具——抗体 135

单元4.1 单克隆抗体的制备 136

基本方案1制备单克隆抗体的免疫方法 136

基本方案2细胞融合与杂交瘤细胞的选择 137

支持方案1筛选原始杂交瘤上清 140

支持方案2杂交瘤细胞系的建立 140

支持方案3用有限稀释法进行克隆化培养 141

支持方案4制备克隆化／扩增培养基 142

单元4.2 多克隆抗体的制备 142

基本方案用弗式佐剂免疫产生多克隆抗体 142

备择方案用其他佐剂免疫产生多克隆抗血清 144

支持方案血清的制备 145

单元4.3 免疫球蛋白G的纯化 145

基本方案1硫酸铵沉淀和分子筛层析 145

基本方案2蛋白A葡聚糖亲和层析 146

备择方案1蛋白G葡聚糖亲和层析 148

备择方案2抗大鼠κ链单克隆抗体结合的葡聚糖亲和层析 148

基本方案3以Tris·Cl为缓冲液的DE52离子交换层析 149

单元4.4 抗体缀合物用于细胞生物学研究 150

基本方案抗体与荧光团或生物素的结合 150

支持方案估计抗体浓度的方法 155

第5章 显微镜术 156

单元5.1 光学显微镜的校准及调节 157

光学显微镜的主要部件 158

亮视场与荧光显微镜术成像及Kohler照明光路的基础知识 162

基本方案1亮视场，透射显微镜术的Kohler照明校准 164

基本方案2目镜的校准 166

基本方案3表面荧光显微镜Kohler照明模式的校准 166

基本方案4相差显微镜术的校准 167

支持方案显微镜光学部件的维护及清洗 169

单元5.2 荧光显微镜术 170

荧光显微镜光学系统 170

荧光显微镜部件 171

数字化暗室 174

单元5.3 免疫荧光染色 175

基本方案培养细胞的免疫荧光标记 175

单元5.4 荧光染料及荧光脂类衍生物标记细胞器 177

基本方案1固定细胞的内质网染色 179

备择方案活细胞内内质网染色 180

基本方案2活细胞内高尔基复合体染色 180

基本方案3线粒体染色 182

单元5.5 基本共聚焦显微镜术 183

光切基础 183

共聚焦显微镜的类型 184

应用指南 187

单元5.6 用免疫过氧化物酶方法定位培养细胞和组织的抗原 191

计划策略 192

基本方案1培养细胞的免疫过氧化物酶染色 192

基本方案2组织的免疫过氧化物酶染色 194

单元5.7 低温免疫金电子显微镜技术 196

基本方案免疫金标记 197

支持方案1用免疫金标记方法固定细胞 198

支持方案2用免疫金标记方法固定组织 198

支持方案3免疫金标记方法做冰冻切片 199

支持方案4 经碳-聚乙烯醇缩甲醛和氯乙聚乙烯醇三元共聚物处理的铜栅格的准备 200

单元5.8 相关的视频光学／电子显微镜术 201

基本方案相关的视频光学／电子显微镜术 201

单元5.9 活细胞内微管和肌动蛋白丝的荧光斑点显微镜技术（FSM） 205

计划策略 205

基本方案1设计一个时延数字化FSM显微镜系统 206

基本方案2活细胞内细胞骨架的时延FSM成像 210

基本方案3时延FSM系列影像的定性和定量分析 212

支持方案1 FSM荧光标记的微管蛋白的制备 213

支持方案2 FSM荧光标记肌动蛋白的制备 216

单元5.10 作为活细胞影像工具的GFP 219

制备融合蛋白 219

第6章 细胞蛋白质的特性 225

单元6.1 膜结合蛋白质的分析 226

基本方案1碱性碳酸盐提取 226

备择方案1尿素提取 227

备择方案2高盐提取 227

备择方案3 Triton X-114相位分离 227

支持方案Triton X-114预浓缩 228

基本方案2磷脂酰肌醇磷脂酶（PI-PLC）水解GPI结合蛋白 228

基本方案3 Triton X-100对不溶性整合膜蛋白和GPI结合蛋白的增溶作用 229

单元6.2 蔗糖密度梯度区带沉淀法测定分子质量 230

基本方案1利用梯度自动形成仪制备蔗糖梯度的区带离心 231

备择方案1用简易梯度形成仪制备蔗糖梯度的区带离心 232

支持方案1普通分子质量标志物的应用和制备 234

基本方案2穿刺法分部收集样品 235

备择方案2管底穿刺蠕动洗脱分离法 236

支持方案2沉降系数的计算 236

单元6.3 体积排阻层析法（凝胶过滤）测定分子质量 237

设计策略 238

基本方案1体积排阻-高效液相层析（SE-HPLC） 239

基本方案2常规体积排阻层析（SEC） 241

第7章 电泳与免疫印迹 244

单元7.1 蛋白质的单向SDS凝胶电泳 246

基本方案变性（SDS）不连续凝胶电泳：Laemmli凝胶法 248

备择方案1 Tris-tricine缓冲液系统的电泳 252

备择方案2在梯度凝胶中分离蛋白质 254

单元7.2 非变性条件下的单向凝胶电泳 256

基本方案非变性聚丙烯酰胺连续电泳 256

备择方案 非变性不连续凝胶电泳以及分子质量标准曲线的绘制 260

单元7.3 双向凝胶电泳 261

基本方案1高分辨率的平衡柱凝胶等电聚焦电泳 262

支持方案1 pH特性的测定 264

备择方案1极端酸性蛋白的非平衡等电聚焦电泳 265

备择方案2极端碱性蛋白的非平衡等电聚焦 265

支持方案2细胞抽提物的等电聚焦 266

基本方案2 IEF柱凝胶的第二向电泳 267

支持方案3标准分子质量蛋白质的双向凝胶 268

备择方案3对角线凝胶电泳（非还原／还原凝胶） 269

单元7.4 蛋白质单向平板凝胶等电聚焦电泳 270

基本方案变性平板凝胶等电聚焦电泳 270

支持方案变性等电聚焦平板凝胶的电转印 271

单元7.5 蛋白质的琼脂糖凝胶 271

基本方案琼脂糖凝胶电泳和印迹的免疫检测 271

单元7.6 凝胶中蛋白质的染色 273

基本方案1考马斯亮蓝染色 273

备择方案等电聚焦后进行考马斯亮蓝染色 274

基本方案2银染法 274

基本方案3蛋白质凝胶的荧光检测 276

基本方案4可逆蛋白锌染法 277

单元7.7 免疫印迹和免疫检测 277

基本方案1用转移槽转印蛋白质 278

备择方案1用半干转移系统转印蛋白质 279

支持方案1转印后蛋白质的可逆染色 280

基本方案2用二抗偶联物进行免疫检测 281

备择方案2用亲和素-生物素偶联的二抗进行免疫检测 282

基本方案3用发色（光）底物显迹 282

支持方案2膜的清洗和再使用 283

单元7.8 凝胶和印迹中放射性标记蛋白的检测和量化 283

基本方案放射性自显影 283

支持方案1固定和干燥用于放射自显影的凝胶 285

支持方案2强化屏的使用 286

备择方案1荧光显影 286

支持方案3光密度计量 287

备择方案2磷光成像 287

第8章 蛋白标记和免疫沉淀 289

单元8.1 用放射性标记的氨基酸进行代谢性标记 290

使用35S标记的化合物的安全预防措施 291

基本方案35S甲硫氨酸脉冲标记悬浮细胞 291

备择方案1 35S甲硫氨酸脉冲标记贴壁细胞 292

备择方案2 35S甲硫氨酸脉冲-追踪标记细胞 293

备择方案3 35S甲硫氨酸长期标记细胞 293

备择方案4用其他放射性标记氨基酸进行的代谢性标记 294

支持方案TCA沉淀确定标记物的结合量 294

单元8.2 用放射性标记的糖代谢性标记糖蛋白 295

基本方案用放射性标记的糖进行脉冲-追踪标记 296

备择方案用放射标记的糖进行的长期标记 297

单元8.3 用放射标记的脂肪酸进行的代谢性标记 298

基本方案用脂肪酸进行的生物合成标记 298

单元8.4 细胞蛋白质的放射性碘化 299

使用125I标记化合物的安全性预防措施 300

基本方案1应用乳糖过氧化物酶对细胞表面进行125I标记 300

基本方案2去垢剂溶解的膜蛋白的碘化 301

支持方案通过均质化进行膜的制备 302

基本方案3乳糖过氧化物酶催化的可溶性蛋白的碘化 302

单元8.5 免疫沉淀 304

基本方案1应用非变性去垢剂裂解悬浮细胞的免疫沉淀 304

备择方案1非变性去垢剂溶液裂解贴壁细胞的免疫沉淀 307

备择方案2变性条件下去垢剂裂解细胞进行的免疫沉淀 308

备择方案3非去垢剂裂解的细胞免疫沉淀 308

基本方案2免疫沉淀-回收 308

单元8.6 酵母蛋白的代谢标记和免疫沉淀 309

基本方案酵母蛋白的标记和免疫沉淀 309

备择方案制备酵母原生质体 311

第9章 蛋白质的磷酸化作用 313

单元9.1 用32P标记培养细胞和制备用于免疫沉淀的细胞裂解物 314

基本方案 用32P标记的培养细胞和使用温和的去垢剂裂解细胞 314

备择方案在SDS中煮沸裂解细胞 315

单元9.2 磷酸化的免疫检测 316

基本方案1应用免疫印迹技术对蛋白质磷酸化的免疫测定 316

基本方案2 由免疫印迹产生的免疫沉淀物来免疫监测蛋白质的磷酸化作用 319

基本方案3组织培养细胞的荧光免疫染色 320

单元9.3 MAP蛋白激酶信号的检测 321

基本方案1通过免疫沉淀反应测定MAP激酶（ERK）的活性 322

基本方案2凝胶内激酶测定 324

基本方案3 JNK测试 325

支持方案GST-JUN-谷胱甘肽珠子的准备 326

第10章 蛋白质转运 328

单元10.1 用糖苷酶研究蛋白质转运 329

基本方案1内切糖苷酶H消化 329

基本方案2肽：N-糖苷酶F消化 330

基本方案3唾液酸酶（神经氨酸苷酶）消化 331

基本方案4 α内切-N-乙酰氨基半乳糖苷酶 332

单元10.2 内吞作用 333

基本方案1测量转铁蛋白受体在表面和内部间的稳态分布 333

基本方案2测量转铁蛋白内化作用动力学 334

备择方案1采用125I标记抗体测量膜蛋白内化作用动力学 335

备择方案2测量悬浮生长细胞的转铁蛋白内化作用动力学 336

基本方案3测量转铁蛋白受体再循环的动力学 337

支持方案1带金属离子的转铁蛋白 338

支持方案2二铁转铁蛋白的放射性标记 338

基本方案4测量液相摄取 339

支持方案3通过撤除钾离子来抑制网格蛋白介导的内吞作用 340

支持方案4通过胞质酸化来抑制网格蛋白介导的内吞作用 340

单元10.3 蛋白质转运到质膜 341

基本方案采用唾液酸酶消化测定到达细胞表面 341

备择方案 通过细胞表面分子的生物素化来测量到达细胞表面 342

单元10.4 极化上皮细胞中的膜转运 343

基本方案1转染极化上皮细胞悬液和选择抗性克隆 344

支持方案1挑取稳定转染的克隆 345

支持方案2在滤器上培养上皮细胞 345

支持方案3测量生长在滤器上的单层细胞的泄漏 347

基本方案2极化上皮细胞中的脉冲-追踪实验 347

基本方案3新合成上皮细胞表面蛋白的生物素化 348

基本方案4极化上皮细胞蛋白的间接免疫荧光分析 349

第11章 细胞增殖，细胞衰老和细胞死亡 351

单元11.1 用流式细胞术确定细胞周期阶段 352

基本方案1用碘化丙啶染色的固定化细胞的细胞周期分析 353

备择方案1用DAPI染色的固定细胞的细胞周期分析 355

基本方案2用PI染色的非固定、去垢剂渗透细胞的细胞周期分析 355

备择方案2用DAPI染色的非固定、去垢剂渗透细胞的细胞周期分析 356

基本方案3活细胞用Hoechst 33342进行染色 356

基本方案4DNA含量和Cyclins D、E、A或B1的二元分析 356

单元11.2 在细胞周期的特定时期细胞同步化的方法 358

基本方案1采用有丝分裂震脱富集有丝分裂细胞 358

备择方案1预富集指数生长培养物用于分离有丝分裂细胞 359

备择方案2通过诺考达唑阻滞富集有丝分裂细胞 359

基本方案2通过血清饥饿富集G0/G1细胞 359

备择方案3通过氨基酸饥饿富集G0/G1细胞 360

基本方案3用洛伐他汀富集G1期细胞 360

备择方案4用含羞草碱阻滞富集G1期细胞 361

基本方案4通过双重胸苷阻滞使细胞在S期起始处达到同步化 361

备择方案5进行连续的G1/S阻滞 362

支持方案1测定有丝分裂指数 363

支持方案2通过TCA沉淀监测3H胸苷掺入DNA 364

单元11.3 分析细胞周期中CDK活性和DNA复制 365

基本方案1测量CDK活性 365

基本方案2用BrdU掺入测量DNA复制 368

单元11.4 通过DNA片段化和形态学标准评价凋亡和坏死 370

基本方案1台盼蓝排斥测量细胞死亡 371

基本方案2细胞的差异染色 371

基本方案3细胞的Hoechst染色 372

支持方案Cytospin制备用于分析的细胞 373

基本方案4细胞DNA片段化的TUNEL分析 373

备择方案1石蜡包埋切片的TUNEL分析 374

基本方案5整个细胞DNA片段化的检测 375

备择方案2总基因组DNA的DNA片段化检测 376

备择方案3检测DNA片段化的简单方案 377

备择方案4用于琼脂糖凝胶电泳的DNA片段的酚抽提 378

基本方案6 DNA片段的定量分析 379

基本方案7用脉冲场琼脂糖凝胶电泳检测高分子质量染色质片段 380

单元11.5 细胞凋亡期间Caspase活化分析 382

基本方案1 Caspase活性的酶促分析 382

基本方案2用免疫印迹检测Caspase活性 384

备择方案1盐酸胍裂解细胞用于免疫印迹 385

支持方案1从印迹上去除（剥离）第一抗体和第二抗体 386

基本方案3用生物素化底物类似物标记和检测活化的Caspases 386

备择方案2用亲和标记测量天然裂解液中的Caspase体外活化 387

支持方案2亲和标记活化Caspase特异性控制 388

支持方案3 d-生物素存在时将膜剥离用于抗体再次杂交 388

第12章 体外重建 390

单元12.1 体外翻译 392

基本方案1 制备和使用依赖mRNA的兔网织红细胞无细胞翻译体系 392

基本方案2依赖mRNA的麦胚无细胞翻译体系的制备和使用 394

基本方案3利用协同转录／翻译体系进行体外蛋白质合成 396

支持方案1无帽体外转录物的制备 397

支持方案2带帽体外转录物的制备 398

备择方案用生物素连接的氨基酸进行体外翻译 399

支持方案3用链霉亲和素-琼脂糖捕获生物素连接的蛋白质 400

单元12.2 蛋白质共翻译转运进入犬粗面微粒体 401

基本方案向犬粗面微粒体的转运 401

支持方案1从犬胰腺制备RM 402

支持方案2制备EDTA剥离的粗面微粒体 404

支持方案3柱洗脱粗面微粒体的制备 404

单元12.3 体外分析哺乳动物细胞中内质网到高尔基体的物质运输 405

基本方案1用半完整细胞重建内质网到高尔基体的运输 405

备择方案 用半完整细胞重建内质网到高尔基体顺面区域的运输 408

基本方案2用哺乳动物细胞微粒体体外重建内质网到高尔基体的运输 408

基本方案3内质网膜泡的体外形成和分离 409

支持方案1 NRK细胞微粒体膜的制备 411

支持方案2 VSV ts045病毒的繁殖 412

基本方案4内质网囊泡与高尔基体膜的融合 412

支持方案3制备大鼠肝细胞细胞液 414

支持方案4从大鼠肝细胞制备高尔基体膜 414

单元12.4 用洋地黄皂苷透化细胞进行核物质输入 416

基本方案贴壁型HeLa细胞中的核物质输入 416

支持方案1制备非洲爪蟾卵细胞细胞液 417

支持方案2制备荧光标记的核输入性底物TRITC-BSA-NLS 419

支持方案3 制备荧光标记的重组核输入性底物GFP-GST-NLS 420

单元12.5 非洲爪蟾间期卵提取物的制备和使用 422

基本方案1制备分裂间期卵提取物 422

备择方案1制备间期细胞的分级分离提取物 424

支持方案1用注射方法获得非洲爪蟾卵细胞 424

基本方案2用分裂间期卵细胞提取物进行核组装 425

支持方案2制备去膜精子染色质作为核组装模板 426

基本方案3体外进行核蛋白输入 429

基本方案4用连续标记DNA方法分析复制过程 430

备择方案2用脉冲标记DNA方法分析复制过程 431

基本方案5制备卵母细胞提取物 431

支持方案3免疫去除方法去除提取物蛋白质 433

支持方案4向提取物中加入目的蛋白 434

单元12.6 利用非洲爪蟾卵细胞提取物分析细胞周期 434

基本方案1制备细胞周期提取物 434

基本方案2制备被CSF抑制的提取物 436

基本方案3制备有丝分裂提取物 438

基本方案4使间期提取物进入有丝分裂 438

备择方案在体外生成复制检验点 439

支持方案1监测提取物的细胞周期状态 440

支持方案2检测组蛋白H1激酶活性 440

支持方案3使被CSF抑制的提取物进入间期 441

单元12.7 有丝分裂纺锤体的体外组装 442

基本方案1分析DMSO和中心体的星体反应 442

基本方案2分析精子DNA“半纺锤体”反应 443

基本方案3分析精子DNA周期性反应 444

基本方案4分析DNA磁珠反应 445

支持方案1制备CSF提取物 446

支持方案2制备罗丹明标记微管蛋白 447

支持方案3马达蛋白的破坏 448

支持方案4甩片反应 449

支持方案5制备DNA包被磁珠 451

单元12.8 利用非洲爪蟾卵提取物研究细胞凋亡 452

基本方案 制备凋亡提取物并检测凋亡过程 452

备择方案 将凋亡分成潜伏时相和执行时相 453

支持方案1检测Caspase3样活性 454

支持方案2利用爪蟾卵提取物制备线粒体 454

支持方案3检测细胞色素c的释放 455

支持方案4用纯化的线粒体和细胞质检测细胞色素c的释放 455

单元12.9 体外转录 456

基本方案利用核提取物进行体外转录反应 456

支持方案1用HeLa细胞制备核提取物 457

支持方案2制备高盐果蝇核提取物 459

支持方案3从分离出的果蝇胚胎核制备可溶性核组分 462

支持方案4体外转录产物的引物延伸分析 462

第13章 细胞黏附与细胞外基质 465

单元13.1 细胞-底物黏附试验 467

基本方案1伸展试验 468

基本方案2附着试验 469

支持方案制备肽-蛋白结合物 471

单元13.2 利用离心力定量测定细胞黏附能力 471

基本方案离心细胞黏附试验 472

单元13.3 依赖钙黏素的细胞-细胞黏附 474

研究策略 474

基本方案1短期聚集培养 474

备择方案长期聚集培养 476

基本方案2混合细胞聚集培养 477

支持方案1以TC处理成纤维细胞使细胞解离 478

支持方案2以TC处理胚胎细胞使细胞解离 478

支持方案3 以LTE或TE处理细胞使细胞解离 479

基本方案3检测钙黏素和连环蛋白 480

基本方案4抑制钙黏素的功能 481

基本方案5在钙黏素缺乏或连环蛋白缺陷的细胞系中，恢复钙黏素的活性 482

单元13.4 分析整合素依赖性黏附 482

基本方案1在基于细胞的试验中分析整合素依赖性黏附 482

基本方案2固相分析整合素-配体相互作用 484

支持方案1整合素的纯化 486

支持方案2抗体与Sepharose的交联 488

支持方案3用生物素标记整合素配体 490

单元13.5 分析由免疫球蛋白超家族细胞黏附分子所介导的细胞-细胞联系 490

基本方案1通过免疫亲和层析技术纯化IgSF-CAM 490

支持方案1制备亲和层析柱 491

支持方案2溶解膜蛋白 492

基本方案2利用荧光微球分析蛋白质的相互作用 493

支持方案3将蛋白质与荧光微球相交联 494

基本方案3蛋白微球与培养细胞的结合 495

基本方案4用骨髓瘤细胞作交互作用试验 496

支持方案4用原生质体融合方法对骨髓瘤细胞进行稳定转染 497

基本方案5神经突外长试验 500

基本方案6在体外抑制CAM-CAM相互作用 500

支持方案5用IgSF-CAM包被细胞培养皿 501

支持方案6硝酸纤维素预先包被玻璃表面 502

单元13.6 纤连蛋白的纯化 502

基本方案1纯化血浆纤连蛋白 502

基本方案2从培养细胞中纯化纤连蛋白 504

备择方案1亲和纯化提取的细胞纤连蛋白 505

备择方案2从条件培养基中纯化人细胞纤连蛋白 505

单元13.7 玻连蛋白的纯化 507

基本方案 507

单元13.8 制备胶冻状的基质 509

基本方案1制备Ⅰ型胶原基质 509

基本方案2制备Matrigel基质 510

备择方案1在Matrigel基质中培养细胞 510

备择方案2在体内使用Matrigel基质做血管发生检验和肿瘤生长试验 511

单元13.9 制备培养的角膜内皮细胞和PF-HR9内胚层细胞分泌的细胞外基质 512

基本方案制备牛角膜内皮细胞胞外基质（BCE-ECM） 512

备择方案制备HR9-ECM 514

支持方案1细胞增殖检验 515

支持方案2细胞分化检验 515

单元13.10 制备培养的成纤维细胞产生的细胞外基质 516

基本方案制备培养的成纤维细胞产生的细胞外基质 516

支持方案1细胞附着检测 517

支持方案2确定细胞的形状 518

支持方案3成纤维细胞来源的三维基质的机械压缩 520

支持方案4成纤维细胞来源的三维结构基质的溶解 521

单元13.11 蛋白聚糖的分离和分析 522

基本方案1从培养细胞分离蛋白聚糖 522

备择方案分离蛋白聚糖库 523

支持方案35SO4或3H葡萄糖胺标记蛋白聚糖 523

基本方案2二乙氨乙基-葡聚糖纤维素进行蛋白聚糖的阴离子交换层析纯化 524

基本方案3按大小排阻的层析法分析蛋白聚糖 524

基本方案4碱性消除法分析葡聚糖胺的大小 525

基本方案5用木瓜蛋白酶消化法分析葡聚糖胺的分子质量 526

基本方案6用裂解酶降解葡聚糖胺，分析葡聚糖胺的含量和蛋白核心 526

基本方案7用硝酸处理法降解硫酸乙酰肝素 527

基本方案8分析葡聚糖胺的类型和核心蛋白 527

基本方案9分析葡聚糖胺的大小 528

基本方案10蛋白聚糖的免疫沉淀 528

单元13.12 基质金属蛋白酶 529

基本方案1活细胞的胶原纤维的溶解和降解 529

支持方案制备大鼠尾腱Ⅰ型胶原 530

基本方案2白明胶／干酪素酶水解图谱分析 532

基本方案3反向酶水解图谱分析 533

第14章 细胞的能动性 535

单元14.1 真核细胞趋化实验 535

策略设计 535

基本方案1滤膜趋化实验 536

支持方案1计算无化学吸引剂时细胞迁入厚滤膜的大约距离 538

基本方案2琼脂糖下趋化实验 539

基本方案3少量细胞趋化实验 540

基本方案4桥趋化实验 541

基本方案5吸管趋化实验 542

单元14.2 侵袭实验 543

基本方案测量经基质的侵袭 543

支持方案准备涂布Matrigel的滤膜 544

单元14.3 细胞牵引力 545

基本方案1检测细胞在起皱底物上的牵引力 545

支持方案1校准微型针 546

备择方案1用另一种聚合物检测细胞在起皱底物上的牵引力 547

备择方案2检测细胞在无皱褶底物上的牵引力 547

支持方案2制备改装的喷枪 548

基本方案2测量在微机械制造的底物上的细胞牵引力 549

支持方案3硅烷化盖玻片 552

支持方案4制备偏光反射立方体 552

单元14.4 细胞损伤实验 553

策略设计 553

基本方案用荧光素右旋糖酐检测培养单层细胞的损伤 554

备择方案1用荧光素右旋糖酐检测哺乳动物组织的损伤 555

备择方案2以白蛋白作为损伤示踪剂检测细胞损伤 557

单元14.5 盘基网柄菌属细胞动力学 558

基本方案1观察单个活细胞内GFP标记的蛋白质 558

备择方案1普遍加入化学吸引剂后的GFP标记蛋白的图像记录 559

备择方案2化学吸引剂梯度作用下的GFP标记蛋白的图像记录 560

基本方案2聚集细胞群和损伤细胞的GFP标记蛋白的图像记录 561

支持方案1质粒构建和转化 561

支持方案2细胞在无营养琼脂上发育的表型筛选 563

第15章 细胞器运动 564

单元15.1 微管／细胞器运动实验 564

基本方案微管／细胞器运动实验 564

支持方案1简单灌流室和盖玻片的制备 567

支持方案2海胆精子轴丝的制备 568

支持方案3猪脑微管蛋白的制备 569

支持方案4大鼠肝细胞溶胶的制备 573

支持方案5大鼠肝细胞器组分的制备 573

单元15.2 肌动蛋白通过肌球蛋白移动的体外运动实验 575

基本方案分析肌动蛋白通过肌球蛋白的移动 575

支持方案1灌流室的制备 577

支持方案2肌动蛋白的纯化 578

支持方案3罗丹明鬼笔环肽标记的肌动蛋白的制备 579

单元15.3 植物细胞的细胞器运动：通过绿色荧光蛋白（GFP）使高尔基复合体和内质网的运动成像 580

基本方案瞬时表达在树叶内质网和高尔基探针可视化方面的应用 580

单元15.4 细胞核运动 582

基本方案细胞核运动实验 582

支持方案1从淋巴细胞分离中心体 585

支持方案2浓缩中心体的滴定 587

支持方案3制备用于细胞核组装的分裂间期提取物 588

支持方案4高速上清液（HSS）的制备 591

支持方案5以DNA包被磁珠作为模板组装细胞核 591

附录 593

附录1 试剂与溶液 593

附录2 实用信息和数据 709

2A 实用测量值和数据 709

2B 细胞生物学研究中常用的药物概要 710

2C 放射性同位素的数据 734

2D 常见荧光的最大吸收和激发波长 738

2E 离心机及转子 743

附录3 常用技术 750

3A 分光光度计测量蛋白质浓度 750

3B 比色法检测和定量总蛋白 753

3C 蛋白质溶液的透析和浓缩 766

3D 用吸收和荧光光谱学定量DNA和RNA 769

3E DNA的PCR酶促扩增：标准程序和优化 772

3F 微量RT-PCR 778

附录4 试剂和仪器设备供应商选录 781

参考文献 827

索引 835