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组织培养的发展 1

组织培养的应用 5

组织培养的类型 11

细胞冻存练习 38

细胞附着 47

细胞间连接 48

生长在matrigel上的A549细胞 49

细胞周期 50

细胞周期的阻滞和进行 51

干细胞的分化 53

细胞相互作用和细胞信号转导 56

细胞系的演化 58

有限的和连续的细胞系染色体数目 60

小型组织培养实验室 64

中型组织培养实验室 64

带有毗邻准备室的组织培养实验室 65

大型组织培养实验室 66

温室 69

洗测水槽和吸管冲洗器 72

液氮储存和冷冻罐储存 74

洁净台 77

通过抽吸回收培养基 79

Integra真空泵 79

倒置显微镜 80

电动加样器 81

移液器 81

带刻度的分装瓶 82

重复移液器 82

自动分装器 83

多头移液器 83

平板加样器 84

平板读数器 84

移液装置 84

闭路电视 85

CO2培养箱 87

CO2培养箱示意图 87

超纯水制备 89

顶盖式高压蒸汽灭菌锅 90

高压蒸汽灭菌器 91

瓶盖式分装器 92

玻璃器皿清洗机 93

显微操作仪和加热器 96

污染的可能性 100

建议的工作区布局 101

布局糟糕的工作区 101

水平洁净台布置 101

开放式工作台的工作区布置 103

持盖方法 103

洁净台的气流 106

废液烧杯 107

移液管插入方法 109

装在盒子中的培养皿 113

向培养瓶充入气体 113

装载过满的吸管筒 118

将吸管安装到移液器上的方法 119

钢瓶及固定 120

用于器械消毒的双层三角乙醇瓶 122

微生物学安全通风橱 127

培养基体积与细胞产量和培养器皿有效面积的关系 136

多孔培养板 136

培养皿 137

塑料培养瓶 137

多面培养瓶 137

小型搅拌培养瓶 138

通气型培养皿 138

通气型培养瓶 138

带螺帽的小瓶和三角瓶 139

非随机生长 140

CellMax中空纤维培养系统 141

饲养层细胞的形态学 144

渗透压计Roebling渗透压计（Camlab）的前面板、样品管和样品接口。该型号适合的样品量为50μl 156

玻璃器皿的清洗与灭菌 196

自动化瓶刷 197

消毒瓶子 198

虹吸移液管清洗机 200

吸管的清洗和消毒 201

半自动吸管填塞器（Bellco） 201

灭菌烤箱 201

包装螺口盖进行灭菌 203

压力和温度的关系 203

水的纯化 207

无菌过滤 216

一次性除菌过滤器 217

大容量过滤 219

蠕动泵过滤器 219

大批量串联式过滤装置 220

可重复使用的过滤器 221

预过滤 226

每只小鼠胚胎的总湿重与细胞产量 235

小鼠胚胎 235

小鼠的解剖 236

自鸡蛋中取出鸡胚 239

原代培养的策略 241

原代外植块培养 243

温胰蛋白酶消化 245

细胞滤器 247

冷胰蛋白酶消化 248

温胰蛋白酶消化和冷胰蛋白酶消化 250

鸡胚的分离 252

用胶原酶解离组织 255

机械法解离 256

不健康细胞 270

生长曲线和维持 273

单层细胞传代 275

连续传代 278

搅拌培养 280

平行培养物和抗生素 283

克隆细胞产量 286

稀释法克隆培养 288

微孔板克隆培养 290

饲养层 294

悬浮克隆培养 297

美希索中的克隆培养 299

克隆培养环 300

单层贴壁细胞克隆的分离培养 302

悬浮细胞克隆的分离培养 304

选择性饲养层 310

黑色素瘤、成纤维细胞和胶质细胞的悬浮生长 310

混杂培养物中过度生长 311

密度梯度法分离细胞 314

密度梯度混合器 315

离心产生的梯度 315

离心淘洗转头（Beckman） 317

淘洗转子的分离室 317

磁力分选法 319

磁性活化细胞分选法（MACS） 319

荧光活化细胞分选法（FACS） 321

流式细胞仪 322

FACSⅡ型打印图 323

隆凸 329

培养细胞形态举例 331

为细胞学观察而设计的培养装置 340

细胞甩片离心机 341

滤膜细胞学 342

染色体制备 345

染色体染色 348

核型制备 349

DNA指纹 355

DNA测序仪 359

DNA绘谱 361

同工酶电泳 363

Agilent免疫分析机 370

分化的调节 377

旁分泌的相互作用 378

克隆变异 388

染色体畸变 389

转化灶 390

hTERT永生化细胞与对照组衰老细胞的累计群体倍增次数（PD）的比较 397

细胞增殖的密度限制 402

鸡心脏测定法 406

滤膜皿侵袭 407

纤维蛋白溶酶原激活剂 408

污染的类型 416

PCR检测支原体 422

冷冻曲线 431

固定并包裹冻存管 431

颈口插头冷冻器 432

Nalge Nunc冷冻器 432

程控冷冻柜 432

液氮罐 434

液氮罐的设计 435

冷冻细胞 438

细胞复苏 440

连续培养更新 442

细胞的运输容器 444

血细胞计数板 447

CASY电子细胞计数器 449

CASY细胞计数器操作示意 450

CASY电子细胞计数器模拟显示 452

Beckman Coulter Vi-CELL电子细胞计数器 453

生长曲线 463

多孔板培养 466

生长曲线的解释 467

饱和密度 469

稀释细胞与进行集落试验 472

贴壁效率的线性分布 474

自动集落计数仪 474

标记指数 475

载片或培养皿的扫描 477

生长分数 477

单层细胞克隆形成实验 485

存活曲线 487

存活曲线的解释 488

饲养层对抵抗分数的作用 488

微滴定试验 491

抑制百分率曲线 493

持续时间的试验 494

IC50下降的时间进程 494

微滴定和克隆性存活之间的相关性 495

器官型试验 501

人脐带血管 551

培养的血管内皮细胞 555

嗅球切除 561

培养的黑素细胞 565

汇合的饲养层 580

胃癌细胞系 585

胰腺癌细胞系 588

人神经胶质细胞瘤细胞系 590

细胞密度对C6细胞GFAP表达的作用 592

组织型培养和器官型培养 594

器官培养 595

球体内的分裂细胞 600

转动室系统 603

Synthecon旋转细胞培养系统 604

滤膜培养皿 607

Transwells 607

支架和基质 613

用MRI检测三维构建物内的细胞 614

软骨构建物的MRI 615

大搅拌瓶 616

搅拌培养 617

生物恒定器 620

空气上升发酵器 621

BelloCell充气器培养 621

中空纤维灌流培养 622

Membrof erm 622

Nunc细胞工厂 623

填充式Nunc细胞工厂 624

Corning CellCube 626

放在支架上的旋转培养瓶 626

旋转瓶培养 627

旋转瓶示例 628

旋转鼓装置 629

固定床反应器 632

液床反应器 632

生物反应器的程序控制 634

NMR分析 635

显微放射自显影术 640

显微放射自显影照片 641

体细胞融合及融合后杂交细胞的筛选 674

杂交瘤的制备 677

转基因 682

第1章 绪论 1

1.1历史背景 1

1.2组织培养的优点 7

1.2.1环境控制 7

1.2.2样品的特征和均一性 8

1.2.3经济、规模和机械化 8

1.2.4体内环境的体外模拟 8

1.3局限性 8

1.3.1专业技能 8

1.3.2量的问题 9

1.3.3去分化和选择 9

1.3.4细胞的起源 9

1.3.5不稳定性 10

1.4体外的主要差异 10

1.5组织培养的类型 10

第2章 培训纲要 13

2.1目的 13

2.2基本练习 13

练习1无菌技术Ⅰ：吸取和移液 15

练习2细胞培养介绍 16

练习3无菌技术Ⅱ：准备培养基 18

练习4单层细胞的换液 19

练习5玻璃器皿的清洗和灭菌 20

练习6水的准备与灭菌 21

练习7无Ca2+和Mg2+的Dulbecco磷酸盐缓冲液（D-PBSA）的制备与灭菌 22

练习8pH标准色阶的制备 23

练习9以干粉配制培养基储液并过滤灭菌 24

练习10用10×浓缩液配制完全培养基 25

练习11以干粉配制完全培养基 27

练习12用血细胞计数板或电子计数器计数细胞 27

练习13悬浮生长细胞的传代 29

练习14单层生长连续细胞系的传代 31

练习15单层细胞的Giemsa染色 33

练习16生长曲线的制作和分析 34

2.3高阶练习 36

练习17培养细胞的冻存 36

练习18支原体的检测 39

练习19细胞系鉴定 40

练习20原代培养 42

练习21单层细胞的克隆培养 43

2.4特殊练习 45

第3章 培养细胞的生物学 46

3.1培养细胞的环境 46

3.2细胞黏附 46

3.2.1细胞黏附分子 46

3.2.2细胞间连接 48

3.2.3细胞外基质 48

3.2.4细胞骨架 49

3.2.5细胞迁移 50

3.3细胞增殖 50

3.3.1细胞周期 50

3.3.2细胞增殖的控制 51

3.4细胞分化 52

3.4.1细胞分化的维持 52

3.4.2细胞去分化 52

3.5细胞信号传递 55

3.6能量代谢 56

3.7培养的开始 57

3.8细胞系的演化 58

3.8.1细胞的衰老 59

3.9连续细胞系的形成 59

3.10培养细胞的起源 60

第4章 实验室设计与布局 62

4.1规划 62

4.2建设与使用 65

4.3无菌室或套室布局 67

4.3.1无菌操作区 67

4.3.2层流原理 67

4.3.3检疫室和防范室 68

4.3.4操作台 68

4.4培养 68

4.4.1培养箱 68

4.4.2温室 69

4.5准备室 71

4.5.1培养基制备 71

4.5.2洗涮 72

4.5.3储存 73

第5章 设备 76

5.1组织培养实验室的要求 76

5.2无菌区 77

5.2.1洁净台 77

5.2.2吸管桶或吸管缸 78

5.2.3抽气泵 78

5.2.4手推车 79

5.2.5倒置显微镜 80

5.2.6离心机 80

5.2.7无菌取液器——移液和分装 80

5.2.8细胞计数器 85

5.2.9视频摄像机和显示器 85

5.2.10解剖镜 85

5.3培养 85

5.3.1培养箱 85

5.3.2湿式CO2培养箱 86

5.3.3温度记录仪 88

5.3.4滚动架 88

5.3.5磁力搅拌器 88

5.4准备和灭菌 88

5.4.1清洗 88

5.4.2水的纯化 89

5.4.3灭菌和干燥烘箱 90

5.4.4蒸汽灭菌器（高压灭菌锅） 90

5.4.5天平 91

5.4.6pH计 91

5.4.7磁力加热搅拌器 92

5.4.8自动分装器 92

5.4.9电导仪 93

5.4.10渗透压计 93

5.4.11玻璃器皿清洗机 93

5.5储存 94

5.5.1冰箱和冷冻箱 94

5.5.2冷藏器 94

5.5.3可控速率冷冻箱 95

5.6实验室 95

5.6.1计算机和网络 95

5.6.2普通显微镜 95

5.6.3低温冷冻箱 95

5.6.4共聚焦显微镜 96

5.6.5PCR循环仪 96

5.7专用设备 96

5.7.1显微注射装置 96

5.7.2集落计数器 96

5.7.3离心淘洗机 96

5.7.4流式细胞仪 97

5.8消耗性物品 97

5.8.1吸管 97

5.8.2血细胞计数板 97

5.8.3培养器皿 98

5.8.4无菌容器 98

5.8.5注射器和针头 98

5.8.6除菌过滤器 98

5.8.7纸巾和棉签 98

5.8.8消毒剂 98

第6章 无菌技术 99

6.1无菌技术的目标 99

6.1.1无菌的维持 99

6.2创造无菌环境的各种因素 100

6.2.1安静的工作区域 100

6.2.2工作面 100

6.2.3个人卫生 102

6.2.4试剂和培养基 102

6.2.5培养物 102

6.3灭菌操作 102

6.3.1擦拭 102

6.3.2加盖 102

6.3.3灼烧 103

6.3.4试剂瓶和培养瓶的操作 103

6.3.5移液 104

6.3.6倒出液体 105

6.4层流 105

6.5标准方法 106

方案6.1在洁净台内进行无菌操作 107

方案6.2在敞开的工作台上进行操作 109

6.5.1培养皿和多孔培养板 111

方案6.3培养皿和培养板的操作 111

6.6仪器和设备 112

6.6.1培养箱 112

6.6.2盒装培养物 113

6.6.3充入CO2气体 113

第7章 安全性、生物伦理及验证 114

7.1实验室安全 114

7.2危险性评估 114

7.3标准操作程序 116

7.4安全规则 116

7.5常规安全 117

7.5.1操作者 118

7.5.2设备 118

7.5.3玻璃器皿和锐利的物品 118

7.5.4化学毒性 119

7.5.5气体 120

7.5.6液氮 120

7.5.7灼烧 121

7.6火 122

7.7放射性 122

7.7.1摄入 122

7.7.2放射性废弃物的处理 122

7.7.3标记的试剂 123

7.7.4高能源 123

7.8生物危害性 123

7.8.1生物防范水平 123

7.8.2微生物学安全通风橱 126

7.8.3人的活检材料 128

7.8.4遗传操作 130

7.8.5生物有害废弃物处理 130

7.8.6熏蒸 130

7.9生物伦理 130

7.9.1动物组织 130

7.9.2人体组织材料 131

7.10验证 132

7.10.1证明 132

7.10.2来源 132

7.10.3污染 132

第8章 培养器皿和附着物 134

8.1附着物 134

8.1.1细胞的附着和生长 134

8.1.2附着材料 134

8.2培养器皿的选择 135

8.2.1细胞产量 135

8.2.2悬浮培养 138

8.2.3通风 138

8.2.4样品制备与分析 139

8.2.5不均匀生长 140

8.2.6价格 140

8.3特殊系统 140

8.3.1透性支持物 140

8.4表面处理 141

8.4.1基质覆盖 141

8.4.2饲养层 142

方案8.1细胞外基质（ECM）的制备 143

8.4.3三维基质 143

8.4.4金属附着物 144

8.4.5非黏附性附着面 144

第9章 成分明确培养基及补充物 146

9.1培养基的发展史 146

9.2物理化学特征 146

9.2.1pH 146

方案9.1pH标准色阶的制备 147

9.2.2CO2和碳酸盐 147

9.2.3缓冲作用 149

9.2.4氧气 155

9.2.5渗透压 155

9.2.6温度 156

9.2.7黏滞度 157

9.2.8表面张力和成泡性 157

9.3平衡盐溶液 157

9.4完全培养基 158

9.4.1氨基酸 158

9.4.2维生素 159

9.4.3盐类 159

9.4.4葡萄糖 159

9.4.5有机补充物 159

9.4.6激素和生长因子 160

9.4.7抗生素 160

9.5血清 161

9.5.1蛋白质 161

9.5.2生长因子 161

9.5.3激素 163

9.5.4营养物及代谢物 164

9.5.5脂类 164

9.5.6矿物质 164

9.5.7抑制物 164

9.6培养基和血清的选择 164

9.6.1批次预约 166

9.6.2血清的测试 167

9.6.3热灭活 167

9.7其他添加物 168

9.7.1氨基酸水解物 168

9.7.2胚胎浸出液 168

9.7.3条件培养基 168

第10章 无血清培养基 169

10.1含血清培养基的缺点 169

10.2无血清培养基的优点 178

10.2.1具有选择性 179

10.2.2调节细胞增殖与分化 179

10.3无血清培养基的缺点 179

10.4血清的替代 179

10.4.1无血清传代培养 180

10.4.2激素 180

10.4.3生长因子 181

10.4.4血清中的营养物质 181

10.4.5蛋白质和多聚胺 181

10.4.6基质 181

10.5无血清培养基的选择 186

10.5.1无血清培养基的商业供应 186

10.5.2血清替代物 186

10.5.3适应无血清培养基 190

10.6无血清培养基的研发 190

10.7无血清培养基的制备 191

10.8无蛋白培养基 191

10.9小结 191

第11章 准备与灭菌 192

11.1准备试剂与用品 192

11.2设备与液体的灭菌 192

11.3设备 193

11.3.1玻璃器皿 193

方案11.1玻璃器皿的准备和灭菌 196

11.3.2玻璃移液管 199

方案11.2玻璃移液管的准备和灭菌 199

11.3.3螺口盖 202

方案11.3螺口盖的准备和灭菌 202

11.3.4清洁剂的选择 204

11.3.5种类繁杂的设备 204

11.3.6可重复使用的灭菌过滤器 205

方案11.4过滤装置的灭菌 205

11.4试剂与培养基 206

11.4.1水 206

方案11.5超纯水（UPW）的制备和灭菌 207

11.4.2平衡盐溶液 208

方案11.6D-PBSA的配制与灭菌 209

11.4.3培养基的配制与灭菌 210

方案11.7用1×储存液配制培养基 210

方案11.8用10×浓缩液配制培养基 212

11.4.4干粉培养基 215

方案11.9以干粉配制培养基 215

11.4.5特制培养基 216

方案11.10特制培养基的配制 217

11.5培养基的灭菌 218

11.5.1可高压灭菌的培养基 218

11.5.2除菌过滤 218

方案11.11用注射器式过滤器灭菌过滤 221

方案11.12用真空过滤瓶灭菌过滤 222

方案11.13用小型串联式过滤器灭菌过滤 223

方案11.14用大型串联式过滤器灭菌过滤 224

11.5.3血清 225

方案11.15血清的收集与灭菌 226

方案11.16血清的透析 229

11.5.4其他试剂的准备与灭菌 229

11.6培养基的质控、检测和储存 230

11.6.1质量控制 230

11.6.2无菌检测 230

11.6.3培养检测 231

11.6.4保存 232

第12章 原代培养 233

12.1原代培养的类型 233

12.2组织分离 234

12.2.1小鼠胚胎 234

方案12.1分离小鼠胚胎 234

12.2.2鸡胚 238

方案12.2分离鸡胚 238

12.2.3人体活检材料 240

方案12.3人体活检组织 240

12.3原代培养 241

12.3.1原代外植 241

方案12.4原代外植 242

12.3.2酶的解离作用 244

12.3.3温胰蛋白酶消化 244

方案12.5温胰蛋白酶解离组织 244

12.3.4低温预处理的胰蛋白酶消化 247

方案12.6冷胰蛋白酶解离组织 248

12.3.5鸡胚器官原基 250

方案12.7鸡胚器官原基 251

12.3.6其他酶解过程 254

12.3.7胶原酶 254

方案12.8胶原酶解离组织 255

12.3.8机械法解离 257

方案12.9利用筛网的机械分离法 258

12.3.9分离活细胞 258

方案12.10富集活细胞 259

12.3.10原代培养小结 261

12.3.11原始记录 261

第13章 传代培养和细胞系 262

13.1传代培养和扩增 262

13.2术语定义 262

13.3培养物的年龄 268

13.4细胞系的命名 268

13.5选择细胞系 268

13.6常规培养 269

13.6.1细胞形态的意义 270

13.6.2培养基的更换 270

方案13.1单层培养细胞更换培养液 271

13.7传代 273

13.7.1传代标准 274

方案13.2单层细胞的传代 276

13.7.2生长周期和传代比率 278

13.7.3传代时的细胞浓度 279

13.7.4悬浮培养细胞的扩增 279

13.7.5悬浮生长细胞的传代 280

方案13.3悬浮细胞传代 281

13.7.6培养条件的标准化 282

13.7.7抗生素的使用 282

13.7.8培养记录 283

第14章 克隆培养及筛选 286

14.1克隆培养 286

方案14.1稀释法克隆培养 287

14.2贴壁率的刺激 291

14.2.1促进克隆生长的条件 291

14.2.2条件培养基 292

方案14.2条件培养基的制备 292

14.2.3饲养层细胞 293

方案14.3饲养层的准备 293

14.3悬浮克隆培养 295

方案14.4琼脂中克隆培养 295

方案14.5美希索中克隆培养 298

14.4细胞克隆的分离 300

方案14.6用克隆环分离细胞克隆 300

方案14.7辐射法分离细胞集落 302

14.4.1单层贴壁细胞克隆的其他分离技术 303

14.4.2悬浮细胞克隆 303

方案14.8悬浮细胞克隆的分离 304

14.5复制性培养 305

14.6选择性抑制剂 305

14.7遗传变异细胞的筛选 306

方案14.9氨甲蝶呤抗性和DHFR扩增 306

14.8细胞与基质的相互作用 308

14.8.1选择性黏附 308

14.8.2选择性脱壁 308

14.8.3基质性质 309

14.8.4选择性饲养层 309

14.8.5半固体培养基选择 309

第15章 细胞分离 312

15.1细胞密度及等密度沉降法 312

方案15.1密度梯度细胞分离法 312

15.2细胞体积与沉降速度 316

15.2.1单位重力沉降 316

15.2.2离心淘洗分离技术 316

15.3以抗体为基础的分离技术 318

15.3.1免疫盘化法 318

15.3.2免疫磁珠分选 318

方案15.2磁性活化细胞分选法（MACS） 320

15.4荧光活化的细胞分选法 321

15.5其他分离技术 324

15.6初试细胞分离者的选择 325

第16章 细胞鉴定 326

16.1鉴定的需求 326

16.2保存记录和身世 326

16.3真实性验证 326

16.3.1种属鉴定 328

16.3.2谱系或组织标记 328

16.3.3独特标记 330

16.3.4转化 330

16.4细胞形态学 330

16.4.1显微镜使用 336

方案16.1倒置显微镜的使用 337

16.4.2染色 338

方案16.2Giemsa染色 338

方案16.3结晶紫染色 339

16.4.3细胞学检查所用培养器皿 339

16.4.4悬浮细胞细胞学研究标本的制备 340

方案16.4利用细胞甩片机制备用于细胞学研究的悬浮细胞 341

方案16.5过滤细胞学 342

16.4.5显微照相技术 343

方案16.6显微镜数码照相 343

16.5染色体含量 344

方案16.7染色体制备 344

16.5.1染色体显带技术 347

16.5.2染色体分析 348

16.5.3染色体彩绘 350

16.6DNA含量 350

16.6.1DNA杂交 350

16.6.2DNA指纹技术 350

方案16.8细胞系的多位点DNA指纹检测 351

16.6.3DNA绘谱 356

方案16.9细胞系的DNA STR谱 356

16.7RNA和蛋白质表达 362

16.8酶活性 362

16.8.1同工酶 363

16.8.2利用Authentikit进行同工酶电泳 363

方案16.10同工酶分析 364

16.9抗原标记 367

16.9.1免疫染色 369

方案16.11间接免疫荧光 369

16.9.2免疫分析 370

16.10分化 371

第17章 分化 372

17.1体内表现型的表达 372

17.1.1去分化 372

17.1.2细胞谱系的选择 372

17.2分化的各个阶段 373

17.3增殖和分化 373

17.4定向和细胞谱系 374

17.5干细胞的可塑性 375

17.6分化标记物 376

17.7诱导分化 377

17.7.1细胞间相互作用 377

17.7.2全身性或外源性因子 379

17.7.3细胞-基质相互作用 382

17.7.4极性和细胞形状 383

17.7.5氧张力 384

17.8分化和恶性 384

17.9应用 384

第18章 转化和永生化 386

18.1细胞系特性的作用 386

18.2什么是转化 387

18.3遗传不稳定性 388

18.3.1染色体畸变 388

18.3.2DNA含量的变化 389

18.4永生性 389

18.4.1衰老的控制 390

18.4.2利用病毒基因产生永生性 391

18.4.3人类成纤维细胞的永生化 392

方案18.1成纤维细胞的永生化 393

18.4.4端粒酶诱导的永生化 396

方案18.2用端粒酶诱导人类间充质干细胞永生化 397

18.4.5转基因小鼠 401

18.5生长控制的异常 401

18.5.1停泊非依赖性 401

18.5.2接触抑制 402

方案18.3细胞增殖的密度限制 403

18.5.3血清依赖性 404

18.5.4肿瘤基因 405

18.6肿瘤发生 405

18.6.1恶性肿瘤 405

18.6.2肿瘤移植 406

18.6.3侵袭性 406

18.6.4血管形成 407

18.6.5纤溶酶原激活剂 407

第19章 污染 409

19.1污染源 409

19.1.1操作人员的技术 411

19.1.2环境 411

19.1.3层流洁净台的使用和维护 412

19.1.4潮湿培养箱 412

方案19.1清洁培养箱 413

19.1.5冷藏设备 413

19.1.6无菌材料 414

19.1.7引入的细胞系和活检材料 414

19.1.8检疫 414

19.2微生物污染的类型 414

19.3污染的检测 415

19.3.1可见的微生物污染 415

19.3.2支原体 417

19.3.3支原体荧光染色 417

方案19.2荧光检测支原体 418

19.3.4PCR检测支原体 419

方案19.3PCR测定支原体 420

19.3.5检测支原体的其他方法 422

19.3.6病毒感染 423

19.4污染的去除 423

19.4.1细菌、真菌和酵母 423

方案19.4消除微生物污染 424

19.4.2支原体的消除 424

19.4.3病毒污染的消除 425

19.4.4持久的污染 425

19.5交叉污染 426

19.6结论 426

第20章 细胞冷冻保存 428

20.1冷冻保存的必要性 428

20.2冷冻保存细胞系的获得 428

20.3冷冻保存的原理 429

20.3.1细胞冷冻的理论基础 429

20.3.2细胞浓度 429

20.3.3冷冻液 430

20.3.4冷冻速率 430

20.3.5细胞冷冻器 433

20.3.6冻存记录 436

20.3.7冻存细胞的复苏 436

方案20.1冷冻细胞 438

方案20.2复苏冷冻的细胞 440

20.4冷冻储备的设计与控制 442

20.4.1冻存细胞的管理 442

20.4.2冻存细胞的连续更替 442

20.5细胞库 443

20.6细胞的运送 443

20.6.1冻存管 443

20.6.2活的培养物 444

第21章 定量 445

21.1细胞计数 445

21.1.1血细胞计数板 445

方案21.1用血细胞计数板进行细胞计数 445

21.1.2电子细胞计数 449

方案21.2借电阻进行电子细胞计数 451

21.1.3单层培养的染色 453

21.2细胞重量 453

21.3DNA含量 454

方案21.3用Hoechst33258测定DNA 454

21.4蛋白质 454

21.4.1样品的溶解性 455

方案21.4用Bradford方法测定蛋白质含量 455

21.5合成率 456

21.5.1DNA合成 456

方案21.5以3H-TdR掺入测定DNA合成 456

21.5.2蛋白质合成 457

方案21.6蛋白质合成 458

21.6酶检测和免疫检测标本的制备 459

21.7细胞计数术 459

21.7.1原位标记 459

21.7.2流式细胞术 459

21.8重复取样问题 459

21.8.1数据的获得 460

21.8.2数据分析 460

21.9细胞增殖 461

21.9.1实验设计 461

21.9.2生长周期 461

方案21.7培养瓶中单层培养细胞生长曲线的绘制 462

方案21.8多孔培养板中单层培养细胞生长曲线的绘制 464

21.9.3单层培养细胞生长曲线的分析 465

21.9.4培养液体积、细胞浓度和细胞密度 466

21.9.5悬浮培养 467

方案21.9悬浮培养细胞生长曲线的绘制 467

21.9.6生长周期分析 468

21.9.7生长曲线的变化 470

21.1.贴壁效率 470

方案21.10贴壁效率的测定 471

21.10.1集落形成的分析 473

21.10.2自动集落计数 473

21.11标记指数 474

方案21.113H-胸腺嘧啶脱氧核苷的标记指数 475

21.11.1生长分数 476

方案21.12生长分数的测定 478

21.11.2有丝分裂指数 478

21.11.3分裂指数 478

21.12细胞周期时间 478

21.13细胞迁移 479

第22章 细胞毒性 480

22.1活性、毒性和存活 480

22.2体外局限性 481

22.3分析的性质 481

22.3.1生存力 482

方案22.1染料排斥法测定细胞生存力 482

方案22.2染料摄取法测定细胞生存力 483

22.3.2存活 484

方案22.3贴壁细胞的克隆形成实验 484

22.3.3细胞增殖测定 489

22.3.4代谢性细胞毒测定 489

22.3.5微滴定试验 489

方案22.4基于MTT的细胞毒性试验 490

22.3.6微滴定与克隆存活的比较 495

22.3.7药物的相互作用 496

22.4细胞毒性试验的应用 496

22.4.1抗癌药物筛选 496

22.4.2肿瘤药物的前瞻性试验 496

22.4.3药物学试验 497

22.5转化和诱变 497

22.5.1姐妹染色单体交换的诱变试验 497

方案22.5姐妹染色单体交换 498

22.5.2致癌性 500

22.6炎症反应 501

第23章 特殊类型细胞的培养 503

23.1特殊细胞培养技术 503

23.2上皮细胞 504

23.2.1表皮 504

方案23.1表皮角质形成细胞 505

23.2.2角膜 510

方案23.2角膜上皮细胞 510

23.2.3乳腺 512

方案23.3乳腺上皮 513

23.2.4子宫颈 514

方案23.4子宫颈上皮 514

23.2.5胃肠道 518

方案23.5结肠隐窝的分离和培养 518

23.2.6肝 520

方案23.6大鼠肝细胞的分离 521

23.2.7胰 523

方案23.7胰腺上皮 523

23.2.8肾 525

方案23.8肾上皮 525

23.2.9气管和支气管上皮 527

方案23.9气管和支气管上皮 527

23.2.10口腔上皮 529

方案23.10口腔角质形成细胞 529

23.2.11前列腺 531

方案23.11前列腺上皮 531

23.3间充质细胞 533

23.3.1结缔组织 533

23.3.2脂肪组织 534

方案23.12脂肪细胞的原代培养 534

23.3.3肌 536

方案23.13平滑肌细胞的分离和培养 536

方案23.14从成年骨骼肌分离和培养成肌细胞 538

方案23.15 从骨骼肌分离和培养单肌纤维 540

23.3.4软骨 542

方案23.16用藻酸盐微珠培养软骨细胞 543

23.3.5骨 546

方案23.17成骨细胞 546

23.3.6内皮细胞 548

方案23.18血管内皮细胞的分离和培养 549

23.4神经外胚层细胞 555

23.4.1神经细胞 555

方案23.19小脑颗粒细胞的培养 556

23.4.2神经胶质细胞 557

方案23.20嗅球成鞘细胞 559

23.4.3内分泌细胞 562

23.4.4黑素细胞 562

方案23.21黑素细胞的培养 563

23.4.5黑素细胞的鉴定 566

23.5造血细胞 566

23.5.1骨髓细胞的长期培养 567

方案23.22骨髓造血细胞的长期培养 567

23.5.2造血细胞克隆形成实验 568

方案23.23造血细胞集落形成实验 569

23.6生殖腺 571

23.7干细胞 571

23.7.1胚胎干细胞 572

23.7.2成体多能干细胞 572

23.7.3干细胞来源和处理 572

第24章 肿瘤细胞培养 574

24.1肿瘤细胞培养中的问题 574

24.2取材 575

24.3分离 576

24.4原代培养 576

24.5肿瘤细胞的特征 577

24.6细胞系的建立 578

24.6.1连续细胞系 578

24.7肿瘤细胞的选择培养 578

24.7.1选择性培养基 578

24.7.2汇合的饲养层 579

方案24.1在汇合的饲养层上培养 579

24.7.3悬浮克隆 581

24.7.4组织型培养 582

24.7.5异种移植 582

24.7.6培养的肿瘤细胞特征 583

24.7.7冷冻保存组织 583

方案24.2冻存活检组织 583

24.8特殊类型肿瘤 584

24.8.1乳腺 584

24.8.2肺 584

24.8.3胃 585

24.8.4结肠 585

方案24.3结肠直肠肿瘤细胞的培养 586

24.8.5胰腺 588

24.8.6卵巢 588

24.8.7前列腺 589

24.8.8膀胱 589

24.8.9皮肤 589

24.8.10子宫颈 590

24.8.11胶质细胞瘤 590

24.8.12神经母细胞瘤 591

24.8.13精原细胞瘤 591

24.8.14淋巴瘤和白血病 591

第25章 器官型培养 592

25.1细胞的相互作用和表型表达 592

25.1.1细胞密度的作用 592

25.1.2相互作用 593

25.1.3模型的选择 593

25.2器官培养 595

25.2.1气体和营养物质的交换 595

25.2.2结构的完整性 596

25.2.3生长与分化 596

25.2.4器官培养的限制 596

25.2.5器官培养的类型 596

方案25.1器官培养 597

25.3组织型培养 598

25.3.1凝胶和海绵技术 598

25.3.2中空纤维 599

25.3.3球体 599

方案25.2球体培养 600

25.3.4转动室系统 603

25.3.5藻酸盐活细胞固定术 604

方案25.3藻酸盐包被 605

25.3.6滤膜培养皿 606

方案25.4滤膜培养皿 607

25.3.7神经聚集物的培养 609

方案25.5神经聚集物 610

25.3.8组织等同物和组织工程 612

25.4三维构建物中细胞的成像 613

第26章 规模培养 616

26.1悬浮规模培养 616

方案26.14L分批式搅拌悬浮培养 617

26.1.1连续培养 619

26.1.2规模和复杂性 620

26.1.3搅匀和换气 620

26.2单层规模培养 623

26.2.1多表面扩增器 623

方案26.2Nunc细胞工厂 624

26.2.2多列阵培养皿、螺旋柱和培养管 625

26.2.3旋转培养 626

方案26.3旋转瓶培养 627

26.2.4微载体 629

方案26.4微载体 630

26.2.5巨载体 631

26.2.6灌流式单层培养 633

26.3程序控制 633

第27章 特殊技术 636

27.1淋巴细胞的分离 636

方案27.1淋巴细胞的分离 636

27.1.1未成熟细胞的转化 637

方案27.2用PHA刺激淋巴细胞 637

27.2放射自显影术 638

方案27.3显微放射自显影术 639

27.3间隔性记录 645

方案27.4间隔性摄像 645

27.4共聚焦显微镜 648

27.5细胞同步化 648

27.5.1细胞分离 648

27.5.2阻断 648

27.6羊膜细胞培养 649

方案27.5羊膜细胞的培养 649

27.7冷血动物细胞的培养 657

27.7.1鱼细胞 657

方案27.6斑马鱼胚胎细胞的培养 658

27.7.2昆虫细胞 662

方案27.7昆虫细胞的扩增 662

27.8原位分子杂交 663

27.8.1采用原位杂交技术对RNA基因表达的分析 663

方案27.8原位杂交中的放射自显影技术 664

27.8.2荧光原位杂交技术在分析基因及染色体中的应用 670

方案27.9利用单拷贝基因组探针及染色体彩绘方法进行荧光原位杂交（FISH） 670

27.9体细胞融合 673

方案27.10细胞杂交 675

27.9.1移核实验 677

27.10单克隆抗体的制备 677

方案27.11单克隆抗体的制备 678

27.11DNA转移 682

27.11.1磷酸钙共沉淀 683

27.11.2脂质体介导的转染 683

方案27.12脂质体介导的瞬时转染 683

27.11.3电穿孔法 685

方案27.13电穿孔法稳定转染 686

27.11.4其他DNA转移方法 688

27.11.5报告基因 688

方案27.14β-半乳糖苷酶的原位染色 688

方案27.15氯霉素乙酰基转移酶（CAT）测定 689

第28章 问题与对策 691

28.1细胞生长缓慢 691

28.1.1个别人的培养体系出现问题 691

28.1.2问题较为普遍，其他人也遇到同样的困难 692

28.1.3实验室是否发生其他变化？ 692

28.2培养基 693

28.2.1培养基的选择 694

28.2.2某些不稳定试剂 695

28.3配制培养基各种成分的纯度 696

28.3.1纯水器工作是否正常？ 696

28.3.2碳酸氢钠 696

28.3.3抗生素 696

28.3.4血清 697

28.4塑料制品 697

28.5玻璃器皿 697

28.5.1洗涤 697

28.6微生物污染 697

28.6.1针对某一位实验者而出现的问题 698

28.6.2针对多位实验者共有的问题 699

28.6.3污染物的鉴定 701

28.6.4排除污染 701

28.7化学污染 701

28.7.1玻璃器皿 701

28.7.2吸液管 702

28.7.3水的纯度 702

28.7.4其他试剂 702

28.7.5粉末和气溶胶 702

28.8原代培养 703

28.8.1原代培养常见的问题 703

28.8.2选择原代培养的细胞不恰当 704

28.8.3污染 704

28.9分化 704

28.9.1细胞不发生分化 704

28.9.2丧失产物形成能力 704

28.10饲养层 705

28.10.1常规单层培养 705

28.10.2克隆培养 705

28.11传代 705

28.11.1传代培养的细胞周期 705

28.11.2老化 706

28.11.3培养基 706

28.11.4生长不均匀 706

28.12克隆 706

28.12.1贴壁率低 706

28.12.2集落弥散 707

28.12.3每个培养皿中集落数目太多 707

28.12.4非随机分布 708

28.12.5细胞不贴壁 708

28.13交叉污染 708

28.13.1交叉污染的“体征” 708

28.13.2交叉污染的“预防” 709

28.13.3交叉污染的“治疗” 709

28.14冻存 709

28.14.1复苏时成活率低 709

28.14.2冻存后细胞形态发生变化 710

28.14.3污染 710

28.14.4存货用罄 710

28.15细胞呈颗粒性 711

28.16细胞计数 711

28.16.1使用血球计数板 711

28.16.2使用有调节喷嘴的电子计数仪 711

28.17存活率 712

28.17.1形态学观察 712

28.17.2存活率检测 713

28.17.3细胞毒性检测 713

第29章 结语 714

附录Ⅰ试剂及配制 715

附录Ⅱ设备及材料来源 727

附录Ⅲ供应商和其他资源 745

附录Ⅳ术语 776

附录Ⅴ普通教科书及相关期刊 782

参考文献 784

索引 830