图书介绍
动物细胞培养 基本技术指南 第5版pdf电子书版本下载
- [英）R.I.弗雷谢尼著 著
- 出版社： 北京：科学出版社
- ISBN：7030207807
- 出版时间：2008
- 标注页数：836页
- 文件大小：265MB
- 文件页数：904页
- 主题词：动物－细胞培养－生物技术
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图书目录
组织培养的发展 1
组织培养的应用 5
组织培养的类型 11
细胞冻存练习 38
细胞附着 47
细胞间连接 48
生长在matrigel上的A549细胞 49
细胞周期 50
细胞周期的阻滞和进行 51
干细胞的分化 53
细胞相互作用和细胞信号转导 56
细胞系的演化 58
有限的和连续的细胞系染色体数目 60
小型组织培养实验室 64
中型组织培养实验室 64
带有毗邻准备室的组织培养实验室 65
大型组织培养实验室 66
温室 69
洗测水槽和吸管冲洗器 72
液氮储存和冷冻罐储存 74
洁净台 77
通过抽吸回收培养基 79
Integra真空泵 79
倒置显微镜 80
电动加样器 81
移液器 81
带刻度的分装瓶 82
重复移液器 82
自动分装器 83
多头移液器 83
平板加样器 84
平板读数器 84
移液装置 84
闭路电视 85
CO2培养箱 87
CO2培养箱示意图 87
超纯水制备 89
顶盖式高压蒸汽灭菌锅 90
高压蒸汽灭菌器 91
瓶盖式分装器 92
玻璃器皿清洗机 93
显微操作仪和加热器 96
污染的可能性 100
建议的工作区布局 101
布局糟糕的工作区 101
水平洁净台布置 101
开放式工作台的工作区布置 103
持盖方法 103
洁净台的气流 106
废液烧杯 107
移液管插入方法 109
装在盒子中的培养皿 113
向培养瓶充入气体 113
装载过满的吸管筒 118
将吸管安装到移液器上的方法 119
钢瓶及固定 120
用于器械消毒的双层三角乙醇瓶 122
微生物学安全通风橱 127
培养基体积与细胞产量和培养器皿有效面积的关系 136
多孔培养板 136
培养皿 137
塑料培养瓶 137
多面培养瓶 137
小型搅拌培养瓶 138
通气型培养皿 138
通气型培养瓶 138
带螺帽的小瓶和三角瓶 139
非随机生长 140
CellMax中空纤维培养系统 141
饲养层细胞的形态学 144
渗透压计Roebling渗透压计（Camlab）的前面板、样品管和样品接口。该型号适合的样品量为50μl 156
玻璃器皿的清洗与灭菌 196
自动化瓶刷 197
消毒瓶子 198
虹吸移液管清洗机 200
吸管的清洗和消毒 201
半自动吸管填塞器（Bellco） 201
灭菌烤箱 201
包装螺口盖进行灭菌 203
压力和温度的关系 203
水的纯化 207
无菌过滤 216
一次性除菌过滤器 217
大容量过滤 219
蠕动泵过滤器 219
大批量串联式过滤装置 220
可重复使用的过滤器 221
预过滤 226
每只小鼠胚胎的总湿重与细胞产量 235
小鼠胚胎 235
小鼠的解剖 236
自鸡蛋中取出鸡胚 239
原代培养的策略 241
原代外植块培养 243
温胰蛋白酶消化 245
细胞滤器 247
冷胰蛋白酶消化 248
温胰蛋白酶消化和冷胰蛋白酶消化 250
鸡胚的分离 252
用胶原酶解离组织 255
机械法解离 256
不健康细胞 270
生长曲线和维持 273
单层细胞传代 275
连续传代 278
搅拌培养 280
平行培养物和抗生素 283
克隆细胞产量 286
稀释法克隆培养 288
微孔板克隆培养 290
饲养层 294
悬浮克隆培养 297
美希索中的克隆培养 299
克隆培养环 300
单层贴壁细胞克隆的分离培养 302
悬浮细胞克隆的分离培养 304
选择性饲养层 310
黑色素瘤、成纤维细胞和胶质细胞的悬浮生长 310
混杂培养物中过度生长 311
密度梯度法分离细胞 314
密度梯度混合器 315
离心产生的梯度 315
离心淘洗转头（Beckman） 317
淘洗转子的分离室 317
磁力分选法 319
磁性活化细胞分选法（MACS） 319
荧光活化细胞分选法（FACS） 321
流式细胞仪 322
FACSⅡ型打印图 323
隆凸 329
培养细胞形态举例 331
为细胞学观察而设计的培养装置 340
细胞甩片离心机 341
滤膜细胞学 342
染色体制备 345
染色体染色 348
核型制备 349
DNA指纹 355
DNA测序仪 359
DNA绘谱 361
同工酶电泳 363
Agilent免疫分析机 370
分化的调节 377
旁分泌的相互作用 378
克隆变异 388
染色体畸变 389
转化灶 390
hTERT永生化细胞与对照组衰老细胞的累计群体倍增次数（PD）的比较 397
细胞增殖的密度限制 402
鸡心脏测定法 406
滤膜皿侵袭 407
纤维蛋白溶酶原激活剂 408
污染的类型 416
PCR检测支原体 422
冷冻曲线 431
固定并包裹冻存管 431
颈口插头冷冻器 432
Nalge Nunc冷冻器 432
程控冷冻柜 432
液氮罐 434
液氮罐的设计 435
冷冻细胞 438
细胞复苏 440
连续培养更新 442
细胞的运输容器 444
血细胞计数板 447
CASY电子细胞计数器 449
CASY细胞计数器操作示意 450
CASY电子细胞计数器模拟显示 452
Beckman Coulter Vi-CELL电子细胞计数器 453
生长曲线 463
多孔板培养 466
生长曲线的解释 467
饱和密度 469
稀释细胞与进行集落试验 472
贴壁效率的线性分布 474
自动集落计数仪 474
标记指数 475
载片或培养皿的扫描 477
生长分数 477
单层细胞克隆形成实验 485
存活曲线 487
存活曲线的解释 488
饲养层对抵抗分数的作用 488
微滴定试验 491
抑制百分率曲线 493
持续时间的试验 494
IC50下降的时间进程 494
微滴定和克隆性存活之间的相关性 495
器官型试验 501
人脐带血管 551
培养的血管内皮细胞 555
嗅球切除 561
培养的黑素细胞 565
汇合的饲养层 580
胃癌细胞系 585
胰腺癌细胞系 588
人神经胶质细胞瘤细胞系 590
细胞密度对C6细胞GFAP表达的作用 592
组织型培养和器官型培养 594
器官培养 595
球体内的分裂细胞 600
转动室系统 603
Synthecon旋转细胞培养系统 604
滤膜培养皿 607
Transwells 607
支架和基质 613
用MRI检测三维构建物内的细胞 614
软骨构建物的MRI 615
大搅拌瓶 616
搅拌培养 617
生物恒定器 620
空气上升发酵器 621
BelloCell充气器培养 621
中空纤维灌流培养 622
Membrof erm 622
Nunc细胞工厂 623
填充式Nunc细胞工厂 624
Corning CellCube 626
放在支架上的旋转培养瓶 626
旋转瓶培养 627
旋转瓶示例 628
旋转鼓装置 629
固定床反应器 632
液床反应器 632
生物反应器的程序控制 634
NMR分析 635
显微放射自显影术 640
显微放射自显影照片 641
体细胞融合及融合后杂交细胞的筛选 674
杂交瘤的制备 677
转基因 682
第1章 绪论 1
1.1历史背景 1
1.2组织培养的优点 7
1.2.1环境控制 7
1.2.2样品的特征和均一性 8
1.2.3经济、规模和机械化 8
1.2.4体内环境的体外模拟 8
1.3局限性 8
1.3.1专业技能 8
1.3.2量的问题 9
1.3.3去分化和选择 9
1.3.4细胞的起源 9
1.3.5不稳定性 10
1.4体外的主要差异 10
1.5组织培养的类型 10
第2章 培训纲要 13
2.1目的 13
2.2基本练习 13
练习1无菌技术Ⅰ：吸取和移液 15
练习2细胞培养介绍 16
练习3无菌技术Ⅱ：准备培养基 18
练习4单层细胞的换液 19
练习5玻璃器皿的清洗和灭菌 20
练习6水的准备与灭菌 21
练习7无Ca2+和Mg2+的Dulbecco磷酸盐缓冲液（D-PBSA）的制备与灭菌 22
练习8pH标准色阶的制备 23
练习9以干粉配制培养基储液并过滤灭菌 24
练习10用10×浓缩液配制完全培养基 25
练习11以干粉配制完全培养基 27
练习12用血细胞计数板或电子计数器计数细胞 27
练习13悬浮生长细胞的传代 29
练习14单层生长连续细胞系的传代 31
练习15单层细胞的Giemsa染色 33
练习16生长曲线的制作和分析 34
2.3高阶练习 36
练习17培养细胞的冻存 36
练习18支原体的检测 39
练习19细胞系鉴定 40
练习20原代培养 42
练习21单层细胞的克隆培养 43
2.4特殊练习 45
第3章 培养细胞的生物学 46
3.1培养细胞的环境 46
3.2细胞黏附 46
3.2.1细胞黏附分子 46
3.2.2细胞间连接 48
3.2.3细胞外基质 48
3.2.4细胞骨架 49
3.2.5细胞迁移 50
3.3细胞增殖 50
3.3.1细胞周期 50
3.3.2细胞增殖的控制 51
3.4细胞分化 52
3.4.1细胞分化的维持 52
3.4.2细胞去分化 52
3.5细胞信号传递 55
3.6能量代谢 56
3.7培养的开始 57
3.8细胞系的演化 58
3.8.1细胞的衰老 59
3.9连续细胞系的形成 59
3.10培养细胞的起源 60
第4章 实验室设计与布局 62
4.1规划 62
4.2建设与使用 65
4.3无菌室或套室布局 67
4.3.1无菌操作区 67
4.3.2层流原理 67
4.3.3检疫室和防范室 68
4.3.4操作台 68
4.4培养 68
4.4.1培养箱 68
4.4.2温室 69
4.5准备室 71
4.5.1培养基制备 71
4.5.2洗涮 72
4.5.3储存 73
第5章 设备 76
5.1组织培养实验室的要求 76
5.2无菌区 77
5.2.1洁净台 77
5.2.2吸管桶或吸管缸 78
5.2.3抽气泵 78
5.2.4手推车 79
5.2.5倒置显微镜 80
5.2.6离心机 80
5.2.7无菌取液器——移液和分装 80
5.2.8细胞计数器 85
5.2.9视频摄像机和显示器 85
5.2.10解剖镜 85
5.3培养 85
5.3.1培养箱 85
5.3.2湿式CO2培养箱 86
5.3.3温度记录仪 88
5.3.4滚动架 88
5.3.5磁力搅拌器 88
5.4准备和灭菌 88
5.4.1清洗 88
5.4.2水的纯化 89
5.4.3灭菌和干燥烘箱 90
5.4.4蒸汽灭菌器（高压灭菌锅） 90
5.4.5天平 91
5.4.6pH计 91
5.4.7磁力加热搅拌器 92
5.4.8自动分装器 92
5.4.9电导仪 93
5.4.10渗透压计 93
5.4.11玻璃器皿清洗机 93
5.5储存 94
5.5.1冰箱和冷冻箱 94
5.5.2冷藏器 94
5.5.3可控速率冷冻箱 95
5.6实验室 95
5.6.1计算机和网络 95
5.6.2普通显微镜 95
5.6.3低温冷冻箱 95
5.6.4共聚焦显微镜 96
5.6.5PCR循环仪 96
5.7专用设备 96
5.7.1显微注射装置 96
5.7.2集落计数器 96
5.7.3离心淘洗机 96
5.7.4流式细胞仪 97
5.8消耗性物品 97
5.8.1吸管 97
5.8.2血细胞计数板 97
5.8.3培养器皿 98
5.8.4无菌容器 98
5.8.5注射器和针头 98
5.8.6除菌过滤器 98
5.8.7纸巾和棉签 98
5.8.8消毒剂 98
第6章 无菌技术 99
6.1无菌技术的目标 99
6.1.1无菌的维持 99
6.2创造无菌环境的各种因素 100
6.2.1安静的工作区域 100
6.2.2工作面 100
6.2.3个人卫生 102
6.2.4试剂和培养基 102
6.2.5培养物 102
6.3灭菌操作 102
6.3.1擦拭 102
6.3.2加盖 102
6.3.3灼烧 103
6.3.4试剂瓶和培养瓶的操作 103
6.3.5移液 104
6.3.6倒出液体 105
6.4层流 105
6.5标准方法 106
方案6.1在洁净台内进行无菌操作 107
方案6.2在敞开的工作台上进行操作 109
6.5.1培养皿和多孔培养板 111
方案6.3培养皿和培养板的操作 111
6.6仪器和设备 112
6.6.1培养箱 112
6.6.2盒装培养物 113
6.6.3充入CO2气体 113
第7章 安全性、生物伦理及验证 114
7.1实验室安全 114
7.2危险性评估 114
7.3标准操作程序 116
7.4安全规则 116
7.5常规安全 117
7.5.1操作者 118
7.5.2设备 118
7.5.3玻璃器皿和锐利的物品 118
7.5.4化学毒性 119
7.5.5气体 120
7.5.6液氮 120
7.5.7灼烧 121
7.6火 122
7.7放射性 122
7.7.1摄入 122
7.7.2放射性废弃物的处理 122
7.7.3标记的试剂 123
7.7.4高能源 123
7.8生物危害性 123
7.8.1生物防范水平 123
7.8.2微生物学安全通风橱 126
7.8.3人的活检材料 128
7.8.4遗传操作 130
7.8.5生物有害废弃物处理 130
7.8.6熏蒸 130
7.9生物伦理 130
7.9.1动物组织 130
7.9.2人体组织材料 131
7.10验证 132
7.10.1证明 132
7.10.2来源 132
7.10.3污染 132
第8章 培养器皿和附着物 134
8.1附着物 134
8.1.1细胞的附着和生长 134
8.1.2附着材料 134
8.2培养器皿的选择 135
8.2.1细胞产量 135
8.2.2悬浮培养 138
8.2.3通风 138
8.2.4样品制备与分析 139
8.2.5不均匀生长 140
8.2.6价格 140
8.3特殊系统 140
8.3.1透性支持物 140
8.4表面处理 141
8.4.1基质覆盖 141
8.4.2饲养层 142
方案8.1细胞外基质（ECM）的制备 143
8.4.3三维基质 143
8.4.4金属附着物 144
8.4.5非黏附性附着面 144
第9章 成分明确培养基及补充物 146
9.1培养基的发展史 146
9.2物理化学特征 146
9.2.1pH 146
方案9.1pH标准色阶的制备 147
9.2.2CO2和碳酸盐 147
9.2.3缓冲作用 149
9.2.4氧气 155
9.2.5渗透压 155
9.2.6温度 156
9.2.7黏滞度 157
9.2.8表面张力和成泡性 157
9.3平衡盐溶液 157
9.4完全培养基 158
9.4.1氨基酸 158
9.4.2维生素 159
9.4.3盐类 159
9.4.4葡萄糖 159
9.4.5有机补充物 159
9.4.6激素和生长因子 160
9.4.7抗生素 160
9.5血清 161
9.5.1蛋白质 161
9.5.2生长因子 161
9.5.3激素 163
9.5.4营养物及代谢物 164
9.5.5脂类 164
9.5.6矿物质 164
9.5.7抑制物 164
9.6培养基和血清的选择 164
9.6.1批次预约 166
9.6.2血清的测试 167
9.6.3热灭活 167
9.7其他添加物 168
9.7.1氨基酸水解物 168
9.7.2胚胎浸出液 168
9.7.3条件培养基 168
第10章 无血清培养基 169
10.1含血清培养基的缺点 169
10.2无血清培养基的优点 178
10.2.1具有选择性 179
10.2.2调节细胞增殖与分化 179
10.3无血清培养基的缺点 179
10.4血清的替代 179
10.4.1无血清传代培养 180
10.4.2激素 180
10.4.3生长因子 181
10.4.4血清中的营养物质 181
10.4.5蛋白质和多聚胺 181
10.4.6基质 181
10.5无血清培养基的选择 186
10.5.1无血清培养基的商业供应 186
10.5.2血清替代物 186
10.5.3适应无血清培养基 190
10.6无血清培养基的研发 190
10.7无血清培养基的制备 191
10.8无蛋白培养基 191
10.9小结 191
第11章 准备与灭菌 192
11.1准备试剂与用品 192
11.2设备与液体的灭菌 192
11.3设备 193
11.3.1玻璃器皿 193
方案11.1玻璃器皿的准备和灭菌 196
11.3.2玻璃移液管 199
方案11.2玻璃移液管的准备和灭菌 199
11.3.3螺口盖 202
方案11.3螺口盖的准备和灭菌 202
11.3.4清洁剂的选择 204
11.3.5种类繁杂的设备 204
11.3.6可重复使用的灭菌过滤器 205
方案11.4过滤装置的灭菌 205
11.4试剂与培养基 206
11.4.1水 206
方案11.5超纯水（UPW）的制备和灭菌 207
11.4.2平衡盐溶液 208
方案11.6D-PBSA的配制与灭菌 209
11.4.3培养基的配制与灭菌 210
方案11.7用1×储存液配制培养基 210
方案11.8用10×浓缩液配制培养基 212
11.4.4干粉培养基 215
方案11.9以干粉配制培养基 215
11.4.5特制培养基 216
方案11.10特制培养基的配制 217
11.5培养基的灭菌 218
11.5.1可高压灭菌的培养基 218
11.5.2除菌过滤 218
方案11.11用注射器式过滤器灭菌过滤 221
方案11.12用真空过滤瓶灭菌过滤 222
方案11.13用小型串联式过滤器灭菌过滤 223
方案11.14用大型串联式过滤器灭菌过滤 224
11.5.3血清 225
方案11.15血清的收集与灭菌 226
方案11.16血清的透析 229
11.5.4其他试剂的准备与灭菌 229
11.6培养基的质控、检测和储存 230
11.6.1质量控制 230
11.6.2无菌检测 230
11.6.3培养检测 231
11.6.4保存 232
第12章 原代培养 233
12.1原代培养的类型 233
12.2组织分离 234
12.2.1小鼠胚胎 234
方案12.1分离小鼠胚胎 234
12.2.2鸡胚 238
方案12.2分离鸡胚 238
12.2.3人体活检材料 240
方案12.3人体活检组织 240
12.3原代培养 241
12.3.1原代外植 241
方案12.4原代外植 242
12.3.2酶的解离作用 244
12.3.3温胰蛋白酶消化 244
方案12.5温胰蛋白酶解离组织 244
12.3.4低温预处理的胰蛋白酶消化 247
方案12.6冷胰蛋白酶解离组织 248
12.3.5鸡胚器官原基 250
方案12.7鸡胚器官原基 251
12.3.6其他酶解过程 254
12.3.7胶原酶 254
方案12.8胶原酶解离组织 255
12.3.8机械法解离 257
方案12.9利用筛网的机械分离法 258
12.3.9分离活细胞 258
方案12.10富集活细胞 259
12.3.10原代培养小结 261
12.3.11原始记录 261
第13章 传代培养和细胞系 262
13.1传代培养和扩增 262
13.2术语定义 262
13.3培养物的年龄 268
13.4细胞系的命名 268
13.5选择细胞系 268
13.6常规培养 269
13.6.1细胞形态的意义 270
13.6.2培养基的更换 270
方案13.1单层培养细胞更换培养液 271
13.7传代 273
13.7.1传代标准 274
方案13.2单层细胞的传代 276
13.7.2生长周期和传代比率 278
13.7.3传代时的细胞浓度 279
13.7.4悬浮培养细胞的扩增 279
13.7.5悬浮生长细胞的传代 280
方案13.3悬浮细胞传代 281
13.7.6培养条件的标准化 282
13.7.7抗生素的使用 282
13.7.8培养记录 283
第14章 克隆培养及筛选 286
14.1克隆培养 286
方案14.1稀释法克隆培养 287
14.2贴壁率的刺激 291
14.2.1促进克隆生长的条件 291
14.2.2条件培养基 292
方案14.2条件培养基的制备 292
14.2.3饲养层细胞 293
方案14.3饲养层的准备 293
14.3悬浮克隆培养 295
方案14.4琼脂中克隆培养 295
方案14.5美希索中克隆培养 298
14.4细胞克隆的分离 300
方案14.6用克隆环分离细胞克隆 300
方案14.7辐射法分离细胞集落 302
14.4.1单层贴壁细胞克隆的其他分离技术 303
14.4.2悬浮细胞克隆 303
方案14.8悬浮细胞克隆的分离 304
14.5复制性培养 305
14.6选择性抑制剂 305
14.7遗传变异细胞的筛选 306
方案14.9氨甲蝶呤抗性和DHFR扩增 306
14.8细胞与基质的相互作用 308
14.8.1选择性黏附 308
14.8.2选择性脱壁 308
14.8.3基质性质 309
14.8.4选择性饲养层 309
14.8.5半固体培养基选择 309
第15章 细胞分离 312
15.1细胞密度及等密度沉降法 312
方案15.1密度梯度细胞分离法 312
15.2细胞体积与沉降速度 316
15.2.1单位重力沉降 316
15.2.2离心淘洗分离技术 316
15.3以抗体为基础的分离技术 318
15.3.1免疫盘化法 318
15.3.2免疫磁珠分选 318
方案15.2磁性活化细胞分选法（MACS） 320
15.4荧光活化的细胞分选法 321
15.5其他分离技术 324
15.6初试细胞分离者的选择 325
第16章 细胞鉴定 326
16.1鉴定的需求 326
16.2保存记录和身世 326
16.3真实性验证 326
16.3.1种属鉴定 328
16.3.2谱系或组织标记 328
16.3.3独特标记 330
16.3.4转化 330
16.4细胞形态学 330
16.4.1显微镜使用 336
方案16.1倒置显微镜的使用 337
16.4.2染色 338
方案16.2Giemsa染色 338
方案16.3结晶紫染色 339
16.4.3细胞学检查所用培养器皿 339
16.4.4悬浮细胞细胞学研究标本的制备 340
方案16.4利用细胞甩片机制备用于细胞学研究的悬浮细胞 341
方案16.5过滤细胞学 342
16.4.5显微照相技术 343
方案16.6显微镜数码照相 343
16.5染色体含量 344
方案16.7染色体制备 344
16.5.1染色体显带技术 347
16.5.2染色体分析 348
16.5.3染色体彩绘 350
16.6DNA含量 350
16.6.1DNA杂交 350
16.6.2DNA指纹技术 350
方案16.8细胞系的多位点DNA指纹检测 351
16.6.3DNA绘谱 356
方案16.9细胞系的DNA STR谱 356
16.7RNA和蛋白质表达 362
16.8酶活性 362
16.8.1同工酶 363
16.8.2利用Authentikit进行同工酶电泳 363
方案16.10同工酶分析 364
16.9抗原标记 367
16.9.1免疫染色 369
方案16.11间接免疫荧光 369
16.9.2免疫分析 370
16.10分化 371
第17章 分化 372
17.1体内表现型的表达 372
17.1.1去分化 372
17.1.2细胞谱系的选择 372
17.2分化的各个阶段 373
17.3增殖和分化 373
17.4定向和细胞谱系 374
17.5干细胞的可塑性 375
17.6分化标记物 376
17.7诱导分化 377
17.7.1细胞间相互作用 377
17.7.2全身性或外源性因子 379
17.7.3细胞-基质相互作用 382
17.7.4极性和细胞形状 383
17.7.5氧张力 384
17.8分化和恶性 384
17.9应用 384
第18章 转化和永生化 386
18.1细胞系特性的作用 386
18.2什么是转化 387
18.3遗传不稳定性 388
18.3.1染色体畸变 388
18.3.2DNA含量的变化 389
18.4永生性 389
18.4.1衰老的控制 390
18.4.2利用病毒基因产生永生性 391
18.4.3人类成纤维细胞的永生化 392
方案18.1成纤维细胞的永生化 393
18.4.4端粒酶诱导的永生化 396
方案18.2用端粒酶诱导人类间充质干细胞永生化 397
18.4.5转基因小鼠 401
18.5生长控制的异常 401
18.5.1停泊非依赖性 401
18.5.2接触抑制 402
方案18.3细胞增殖的密度限制 403
18.5.3血清依赖性 404
18.5.4肿瘤基因 405
18.6肿瘤发生 405
18.6.1恶性肿瘤 405
18.6.2肿瘤移植 406
18.6.3侵袭性 406
18.6.4血管形成 407
18.6.5纤溶酶原激活剂 407
第19章 污染 409
19.1污染源 409
19.1.1操作人员的技术 411
19.1.2环境 411
19.1.3层流洁净台的使用和维护 412
19.1.4潮湿培养箱 412
方案19.1清洁培养箱 413
19.1.5冷藏设备 413
19.1.6无菌材料 414
19.1.7引入的细胞系和活检材料 414
19.1.8检疫 414
19.2微生物污染的类型 414
19.3污染的检测 415
19.3.1可见的微生物污染 415
19.3.2支原体 417
19.3.3支原体荧光染色 417
方案19.2荧光检测支原体 418
19.3.4PCR检测支原体 419
方案19.3PCR测定支原体 420
19.3.5检测支原体的其他方法 422
19.3.6病毒感染 423
19.4污染的去除 423
19.4.1细菌、真菌和酵母 423
方案19.4消除微生物污染 424
19.4.2支原体的消除 424
19.4.3病毒污染的消除 425
19.4.4持久的污染 425
19.5交叉污染 426
19.6结论 426
第20章 细胞冷冻保存 428
20.1冷冻保存的必要性 428
20.2冷冻保存细胞系的获得 428
20.3冷冻保存的原理 429
20.3.1细胞冷冻的理论基础 429
20.3.2细胞浓度 429
20.3.3冷冻液 430
20.3.4冷冻速率 430
20.3.5细胞冷冻器 433
20.3.6冻存记录 436
20.3.7冻存细胞的复苏 436
方案20.1冷冻细胞 438
方案20.2复苏冷冻的细胞 440
20.4冷冻储备的设计与控制 442
20.4.1冻存细胞的管理 442
20.4.2冻存细胞的连续更替 442
20.5细胞库 443
20.6细胞的运送 443
20.6.1冻存管 443
20.6.2活的培养物 444
第21章 定量 445
21.1细胞计数 445
21.1.1血细胞计数板 445
方案21.1用血细胞计数板进行细胞计数 445
21.1.2电子细胞计数 449
方案21.2借电阻进行电子细胞计数 451
21.1.3单层培养的染色 453
21.2细胞重量 453
21.3DNA含量 454
方案21.3用Hoechst33258测定DNA 454
21.4蛋白质 454
21.4.1样品的溶解性 455
方案21.4用Bradford方法测定蛋白质含量 455
21.5合成率 456
21.5.1DNA合成 456
方案21.5以3H-TdR掺入测定DNA合成 456
21.5.2蛋白质合成 457
方案21.6蛋白质合成 458
21.6酶检测和免疫检测标本的制备 459
21.7细胞计数术 459
21.7.1原位标记 459
21.7.2流式细胞术 459
21.8重复取样问题 459
21.8.1数据的获得 460
21.8.2数据分析 460
21.9细胞增殖 461
21.9.1实验设计 461
21.9.2生长周期 461
方案21.7培养瓶中单层培养细胞生长曲线的绘制 462
方案21.8多孔培养板中单层培养细胞生长曲线的绘制 464
21.9.3单层培养细胞生长曲线的分析 465
21.9.4培养液体积、细胞浓度和细胞密度 466
21.9.5悬浮培养 467
方案21.9悬浮培养细胞生长曲线的绘制 467
21.9.6生长周期分析 468
21.9.7生长曲线的变化 470
21.1.贴壁效率 470
方案21.10贴壁效率的测定 471
21.10.1集落形成的分析 473
21.10.2自动集落计数 473
21.11标记指数 474
方案21.113H-胸腺嘧啶脱氧核苷的标记指数 475
21.11.1生长分数 476
方案21.12生长分数的测定 478
21.11.2有丝分裂指数 478
21.11.3分裂指数 478
21.12细胞周期时间 478
21.13细胞迁移 479
第22章 细胞毒性 480
22.1活性、毒性和存活 480
22.2体外局限性 481
22.3分析的性质 481
22.3.1生存力 482
方案22.1染料排斥法测定细胞生存力 482
方案22.2染料摄取法测定细胞生存力 483
22.3.2存活 484
方案22.3贴壁细胞的克隆形成实验 484
22.3.3细胞增殖测定 489
22.3.4代谢性细胞毒测定 489
22.3.5微滴定试验 489
方案22.4基于MTT的细胞毒性试验 490
22.3.6微滴定与克隆存活的比较 495
22.3.7药物的相互作用 496
22.4细胞毒性试验的应用 496
22.4.1抗癌药物筛选 496
22.4.2肿瘤药物的前瞻性试验 496
22.4.3药物学试验 497
22.5转化和诱变 497
22.5.1姐妹染色单体交换的诱变试验 497
方案22.5姐妹染色单体交换 498
22.5.2致癌性 500
22.6炎症反应 501
第23章 特殊类型细胞的培养 503
23.1特殊细胞培养技术 503
23.2上皮细胞 504
23.2.1表皮 504
方案23.1表皮角质形成细胞 505
23.2.2角膜 510
方案23.2角膜上皮细胞 510
23.2.3乳腺 512
方案23.3乳腺上皮 513
23.2.4子宫颈 514
方案23.4子宫颈上皮 514
23.2.5胃肠道 518
方案23.5结肠隐窝的分离和培养 518
23.2.6肝 520
方案23.6大鼠肝细胞的分离 521
23.2.7胰 523
方案23.7胰腺上皮 523
23.2.8肾 525
方案23.8肾上皮 525
23.2.9气管和支气管上皮 527
方案23.9气管和支气管上皮 527
23.2.10口腔上皮 529
方案23.10口腔角质形成细胞 529
23.2.11前列腺 531
方案23.11前列腺上皮 531
23.3间充质细胞 533
23.3.1结缔组织 533
23.3.2脂肪组织 534
方案23.12脂肪细胞的原代培养 534
23.3.3肌 536
方案23.13平滑肌细胞的分离和培养 536
方案23.14从成年骨骼肌分离和培养成肌细胞 538
方案23.15 从骨骼肌分离和培养单肌纤维 540
23.3.4软骨 542
方案23.16用藻酸盐微珠培养软骨细胞 543
23.3.5骨 546
方案23.17成骨细胞 546
23.3.6内皮细胞 548
方案23.18血管内皮细胞的分离和培养 549
23.4神经外胚层细胞 555
23.4.1神经细胞 555
方案23.19小脑颗粒细胞的培养 556
23.4.2神经胶质细胞 557
方案23.20嗅球成鞘细胞 559
23.4.3内分泌细胞 562
23.4.4黑素细胞 562
方案23.21黑素细胞的培养 563
23.4.5黑素细胞的鉴定 566
23.5造血细胞 566
23.5.1骨髓细胞的长期培养 567
方案23.22骨髓造血细胞的长期培养 567
23.5.2造血细胞克隆形成实验 568
方案23.23造血细胞集落形成实验 569
23.6生殖腺 571
23.7干细胞 571
23.7.1胚胎干细胞 572
23.7.2成体多能干细胞 572
23.7.3干细胞来源和处理 572
第24章 肿瘤细胞培养 574
24.1肿瘤细胞培养中的问题 574
24.2取材 575
24.3分离 576
24.4原代培养 576
24.5肿瘤细胞的特征 577
24.6细胞系的建立 578
24.6.1连续细胞系 578
24.7肿瘤细胞的选择培养 578
24.7.1选择性培养基 578
24.7.2汇合的饲养层 579
方案24.1在汇合的饲养层上培养 579
24.7.3悬浮克隆 581
24.7.4组织型培养 582
24.7.5异种移植 582
24.7.6培养的肿瘤细胞特征 583
24.7.7冷冻保存组织 583
方案24.2冻存活检组织 583
24.8特殊类型肿瘤 584
24.8.1乳腺 584
24.8.2肺 584
24.8.3胃 585
24.8.4结肠 585
方案24.3结肠直肠肿瘤细胞的培养 586
24.8.5胰腺 588
24.8.6卵巢 588
24.8.7前列腺 589
24.8.8膀胱 589
24.8.9皮肤 589
24.8.10子宫颈 590
24.8.11胶质细胞瘤 590
24.8.12神经母细胞瘤 591
24.8.13精原细胞瘤 591
24.8.14淋巴瘤和白血病 591
第25章 器官型培养 592
25.1细胞的相互作用和表型表达 592
25.1.1细胞密度的作用 592
25.1.2相互作用 593
25.1.3模型的选择 593
25.2器官培养 595
25.2.1气体和营养物质的交换 595
25.2.2结构的完整性 596
25.2.3生长与分化 596
25.2.4器官培养的限制 596
25.2.5器官培养的类型 596
方案25.1器官培养 597
25.3组织型培养 598
25.3.1凝胶和海绵技术 598
25.3.2中空纤维 599
25.3.3球体 599
方案25.2球体培养 600
25.3.4转动室系统 603
25.3.5藻酸盐活细胞固定术 604
方案25.3藻酸盐包被 605
25.3.6滤膜培养皿 606
方案25.4滤膜培养皿 607
25.3.7神经聚集物的培养 609
方案25.5神经聚集物 610
25.3.8组织等同物和组织工程 612
25.4三维构建物中细胞的成像 613
第26章 规模培养 616
26.1悬浮规模培养 616
方案26.14L分批式搅拌悬浮培养 617
26.1.1连续培养 619
26.1.2规模和复杂性 620
26.1.3搅匀和换气 620
26.2单层规模培养 623
26.2.1多表面扩增器 623
方案26.2Nunc细胞工厂 624
26.2.2多列阵培养皿、螺旋柱和培养管 625
26.2.3旋转培养 626
方案26.3旋转瓶培养 627
26.2.4微载体 629
方案26.4微载体 630
26.2.5巨载体 631
26.2.6灌流式单层培养 633
26.3程序控制 633
第27章 特殊技术 636
27.1淋巴细胞的分离 636
方案27.1淋巴细胞的分离 636
27.1.1未成熟细胞的转化 637
方案27.2用PHA刺激淋巴细胞 637
27.2放射自显影术 638
方案27.3显微放射自显影术 639
27.3间隔性记录 645
方案27.4间隔性摄像 645
27.4共聚焦显微镜 648
27.5细胞同步化 648
27.5.1细胞分离 648
27.5.2阻断 648
27.6羊膜细胞培养 649
方案27.5羊膜细胞的培养 649
27.7冷血动物细胞的培养 657
27.7.1鱼细胞 657
方案27.6斑马鱼胚胎细胞的培养 658
27.7.2昆虫细胞 662
方案27.7昆虫细胞的扩增 662
27.8原位分子杂交 663
27.8.1采用原位杂交技术对RNA基因表达的分析 663
方案27.8原位杂交中的放射自显影技术 664
27.8.2荧光原位杂交技术在分析基因及染色体中的应用 670
方案27.9利用单拷贝基因组探针及染色体彩绘方法进行荧光原位杂交（FISH） 670
27.9体细胞融合 673
方案27.10细胞杂交 675
27.9.1移核实验 677
27.10单克隆抗体的制备 677
方案27.11单克隆抗体的制备 678
27.11DNA转移 682
27.11.1磷酸钙共沉淀 683
27.11.2脂质体介导的转染 683
方案27.12脂质体介导的瞬时转染 683
27.11.3电穿孔法 685
方案27.13电穿孔法稳定转染 686
27.11.4其他DNA转移方法 688
27.11.5报告基因 688
方案27.14β-半乳糖苷酶的原位染色 688
方案27.15氯霉素乙酰基转移酶（CAT）测定 689
第28章 问题与对策 691
28.1细胞生长缓慢 691
28.1.1个别人的培养体系出现问题 691
28.1.2问题较为普遍，其他人也遇到同样的困难 692
28.1.3实验室是否发生其他变化？ 692
28.2培养基 693
28.2.1培养基的选择 694
28.2.2某些不稳定试剂 695
28.3配制培养基各种成分的纯度 696
28.3.1纯水器工作是否正常？ 696
28.3.2碳酸氢钠 696
28.3.3抗生素 696
28.3.4血清 697
28.4塑料制品 697
28.5玻璃器皿 697
28.5.1洗涤 697
28.6微生物污染 697
28.6.1针对某一位实验者而出现的问题 698
28.6.2针对多位实验者共有的问题 699
28.6.3污染物的鉴定 701
28.6.4排除污染 701
28.7化学污染 701
28.7.1玻璃器皿 701
28.7.2吸液管 702
28.7.3水的纯度 702
28.7.4其他试剂 702
28.7.5粉末和气溶胶 702
28.8原代培养 703
28.8.1原代培养常见的问题 703
28.8.2选择原代培养的细胞不恰当 704
28.8.3污染 704
28.9分化 704
28.9.1细胞不发生分化 704
28.9.2丧失产物形成能力 704
28.10饲养层 705
28.10.1常规单层培养 705
28.10.2克隆培养 705
28.11传代 705
28.11.1传代培养的细胞周期 705
28.11.2老化 706
28.11.3培养基 706
28.11.4生长不均匀 706
28.12克隆 706
28.12.1贴壁率低 706
28.12.2集落弥散 707
28.12.3每个培养皿中集落数目太多 707
28.12.4非随机分布 708
28.12.5细胞不贴壁 708
28.13交叉污染 708
28.13.1交叉污染的“体征” 708
28.13.2交叉污染的“预防” 709
28.13.3交叉污染的“治疗” 709
28.14冻存 709
28.14.1复苏时成活率低 709
28.14.2冻存后细胞形态发生变化 710
28.14.3污染 710
28.14.4存货用罄 710
28.15细胞呈颗粒性 711
28.16细胞计数 711
28.16.1使用血球计数板 711
28.16.2使用有调节喷嘴的电子计数仪 711
28.17存活率 712
28.17.1形态学观察 712
28.17.2存活率检测 713
28.17.3细胞毒性检测 713
第29章 结语 714
附录Ⅰ试剂及配制 715
附录Ⅱ设备及材料来源 727
附录Ⅲ供应商和其他资源 745
附录Ⅳ术语 776
附录Ⅴ普通教科书及相关期刊 782
参考文献 784
索引 830