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第一章 绪论 1

第一节 基因工程的内容与应用 1

一、基因工程的概念 1

二、基因工程的技术流程 1

三、基因工程的基本条件 2

四、基因工程的技术策略 3

五、基因工程的作用与影响 4

第二节 基因工程的发展历程和理论基础 5

一、基因工程的发展历程 5

二、基因工程理论基础和技术支撑 8

第三节 学习基因工程课程的意义和方法 9

一、学习和研究基因工程的意义 9

二、学习基因工程的方法 10

思考题 11

第二章 基因工程的酶学基础 12

第一节 限制性内切核酸酶 12

一、限制-修饰系统 12

二、限制性内切核酸酶的类型 13

三、限制性内切核酸酶的命名 14

四、Ⅱ型限制内切核酸酶的基本特性 14

五、影响限制性内切核酸酶活性的因素 18

六、限制性内切核酸酶对DNA的消化作用 19

第二节 DNA连接酶 21

一、DNA连接酶的发现 21

二、DNA连接酶的特点 21

三、DNA连接酶的作用机理 22

四、影响连接反应的因素 23

第三节 DNA聚合酶和反转录酶 25

一、DNA聚合酶 25

二、反转录酶 29

第四节 DNA修饰酶 29

一、末端脱氧核苷酸转移酶 29

二、T4多核苷酸激酶 30

三、碱性磷酸酶 31

第五节 外切核酸酶 32

一、大肠杆菌外切核酸酶 32

二、双链外切核酸酶 33

第六节 单链内切核酸酶 34

一、S1核酸酶 34

二、Bal 31核酸酶 34

三、脱氧核糖核酸酶Ⅰ 35

第七节 RNA酶 36

一、核糖核酸酶A 36

二、核糖核酸酶H 36

三、核糖核酸酶T1 36

思考题 37

第三章 载体 38

第一节 克隆载体 38

一、质粒载体 38

二、噬菌体载体 41

三、噬菌体-质粒杂合载体 46

四、人工染色体及其应用 48

第二节 表达载体 50

一、质粒表达载体 50

二、病毒表达载体 55

三、大片段表达载体 59

第三节 特殊用途的载体 60

一、插入或定点整合突变载体 60

二、启动子探针型表达载体 61

三、RNAi载体 62

思考题 64

第四章 基因工程的主要技术及其原理 65

第一节 DNA和RNA的提取和纯化 65

一、DNA提取的基本原理与方法 65

二、RNA提取的基本原理与方法 68

三、DNA或RNA浓度、纯度和相对分子质量的测定 69

第二节 凝胶电泳 70

一、琼脂糖凝胶电泳 71

二、琼脂糖变性胶电泳 72

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 72

四、脉冲电场凝胶电泳 73

五、凝胶电泳中DNA的检测 74

第三节 核酸和蛋白质的分子杂交 74

一、探针的标记 74

二、Southern杂交 76

三、Northern杂交 77

四、菌落（或噬菌斑）杂交 77

五、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 78

六、Western杂交 78

七、液相杂交 79

第四节 聚合酶链式反应技术 79

一、PCR技术原理 79

二、PCR反应体系 80

三、PCR技术的应用 83

第五节 DNA序列分析 86

一、Maxarn-Gilbert化学降解法 86

二、Sanger双脱氧链终止法 87

三、DNA的自动测序 88

四、DNA的测序策略 88

五、核苷酸序列的生物信息学分析 89

第六节 基因定点诱变 90

一、盒式诱变 90

二、寡核苷酸引物诱变 90

三、PCR诱变 91

第七节 DNA与蛋白质互作分析 92

一、酵母单杂交系统 92

二、凝胶阻滞试验 93

三、DNaseⅠ足迹试验 94

四、DNA与蛋白质互作的免疫沉淀分析 94

思考题 95

第五章 目的基因的获得 97

第一节PCR扩增获得目的基因或cDNA 97

一、已知序列基因的PCR扩增 97

二、常规PCR衍生的几种基因克隆技术 98

第二节 基因组文库的构建与基因分离 104

一、基因组文库的类型 104

二、构建基因组文库应满足的条件 105

三、基因组文库的构建 106

四、其他载体基因组文库的构建 112

五、基因组文库的扩增筛选 113

第三节 cDNA文库的构建与筛选 116

一、cDNA文库的特征及发展 116

二、构建cDNA文库应满足的条件 117

三、cDNA文库的构建 118

四、cDNA文库的筛选 122

第四节 根据基因差异表达获得目的基因 124

一、差异显示PCR 124

二、cDNA代表性差异分析 125

三、抑制性削减杂交 126

四、RNA任意引物PCR 127

第五节 基因的化学合成 127

一、寡聚核苷酸单链的化学合成 127

二、探针的化学合成 128

三、连接子和接头的合成 128

四、基因的半合成（酶促合成） 128

五、全长基因化学合成 128

思考题 129

第六章 DNA重组的操作 130

第一节 DNA的体外重组 130

一、黏性末端的连接 130

二、平末端的连接 132

三、PCR产物的连接 135

四、Gateway载体构建系统 136

第二节 重组体导入受体细胞的原理与技术 139

一、重组DNA导入大肠杆菌的方法 139

二、重组DNA导入真核细胞的方法 143

三、转化率及其影响因素 150

第三节 重组子的筛选与鉴定 152

一、载体表型选择法 152

二、根据插入基因的表型选择法 153

三、DNA电泳检测法 153

四、PCR检测法 154

五、核酸杂交检测法 154

六、免疫化学检测法 154

七、DNA序列分析 155

思考题 156

第七章 外源基因的表达及其优化策略 157

第一节 影响外源基因表达的因素 157

一、阅读框架对转化基因表达的影响 157

二、顺式作用元件对基因表达的影响 157

三、翻译过程对表达的影响 160

四、表达系统对表达产物的影响 161

第二节 外源基因在原核细胞中的表达 161

一、原核生物基因表达与调控的特点 162

二、原核生物基因表达载体的组成特征 162

三、原核生物基因表达的受体系统 164

四、优化外源基因在原核细胞中表达的策略 165

第三节 外源基因在真核细胞中的表达 168

一、真核生物基因表达与调控的特点 169

二、真核生物基因表达载体的组成特征 169

三、真核表达的受体系统 173

四、优化外源基因在真核细胞中表达的策略 174

思考题 176

第八章 外源基因表达产物的分离纯化 177

第一节 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 177

一、纯化策略的制定 177

二、层析类型的选择 179

三、多种分离纯化技术的联合应用 180

四、合适分离纯化介质的选择 181

五、分离纯化过程的规模 182

第二节 不同表达形式的蛋白质分离纯化 183

一、分离纯化的一般步骤 183

二、大肠杆菌表达的重组蛋白质的分离纯化 190

三、哺乳动物细胞表达的重组蛋白质的分离纯化 200

第三节 重组蛋白质的质量检测 203

一、重组蛋白质的质量控制指标 203

二、重组蛋白的质量检测项目与方法 206

三、重组蛋白质的保存 207

思考题 207

第九章 基因工程的应用 209

第一节 植物基因工程的应用 209

一、植物基因工程技术流程 209

二、植物基因工程的应用 213

三、基因工程与常规育种相结合进行作物遗传改良 221

第二节 动物基因工程的应用 222

一、动物基因工程的技术流程 222

二、动物基因工程的应用 224

第三节 微生物基因工程的应用 226

一、微生物基因工程的技术流程 226

二、微生物基因工程的应用 226

思考题 232

第十章 基因工程及其产品安全性管理 233

第一节 基因工程的安全性问题 233

一、基因工程产品对人类健康的安全性 233

二、基因工程对生态系统的安全性 234

三、转基因生物与农业生产的安全性 235

四、基因工程与伦理道德 236

五、基因工程与动物权益保护 238

第二节 基因工程的安全性评价 239

一、基因工程生态安全性评价 239

二、基因工程食品安全性评价 240

第三节 基因工程安全管理 244

一、生物安全管理 244

二、中国转基因生物的安全管理 246

思考题 248

主要参考文献 249