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1 概述 1

1.1 基因工程的基本概念 1

1.1.1 基因工程的基本定义 1

1.1.2 基因工程的基本过程 2

1.1.3 基因工程的基本原理 2

1.2 基因工程的发展历史 4

1.2.1 基因工程的诞生 4

1.2.2 基因工程的成熟 4

1.2.3 基因工程的腾飞 5

1.3 基因工程研究的意义 5

1.3.1 第四次工业大革命 6

1.3.2 第二次农业大革命 6

1.3.3 第四次医学大革命 7

2 基因的表达调控原理 8

2.1 启动子调控模型 8

2.1.1 启动子的组成及其功能 8

2.1.2 启动子的顺式增强作用 13

2.1.3 启动子的反式协同作用 15

2.1.4 启动子结构的多样性选择 20

2.2 操纵子调控模型 25

2.2.1 操纵子基因表达调控的基本原理 25

2.2.2 乳糖操纵子 26

2.2.3 半乳糖操纵子 31

2.2.4 阿拉伯糖操纵子 33

2.2.5 色氨酸操纵子 36

2.2.6 λ-噬菌体的操纵子 36

2.3 感受应答调控模型 43

2.3.1 感受应答调控模型的基本原理 44

2.3.2 真核生物转录调控元件的相互作用 46

2.3.3 真核生物转录调控因子的激活方式 49

2.4 RNA结构调控模型 52

2.4.1 终止子的工作原理 52

2.4.2 衰减子的工作原理 59

2.4.3 反义子的工作原理 65

2.5 RNA剪切编辑调控模型 70

2.5.1 RNA的正常剪切模式 70

2.5.2 RNA的选择性剪切 76

2.5.3 RNA的选择性编辑 80

3 DNA重组克隆的单元操作 84

3.1 DNA重组的载体 84

3.1.1 质粒载体 85

3.1.2 λ-双链噬菌体DNA载体 90

3.1.3 M13单链噬菌体DNA载体 96

3.1.4 噬菌体-质粒杂合载体 99

3.2 DNA的体外重组(切与接) 100

3.2.1 限制性核酸内切酶 101

3.2.2 T4-DNA连接酶 106

3.2.3 其他用于DNA重组的工具酶 107

3.2.4 DNA切接反应的影响因素 110

3.2.5 DNA分子重组的方法 114

3.3 重组DNA分子的转化与扩增(转与增) 124

3.3.1 重组DNA转化的基本概念 124

3.3.2 受体细胞的选择 125

3.3.3 转化方法 127

3.3.4 转化率及其影响因素 131

3.3.5 转化细胞的扩增 132

3.4 转化子的筛选与重组子的鉴定(检) 132

3.4.1 载体遗传标记法 133

3.4.2 菌落原位杂交法 136

3.4.3 限制性酶切图谱法 144

3.4.4 克隆基因定位法 146

3.4.5 DNA序列测定法 150

3.4.6 外源基因表达产物检测法 164

3.5 目的基因的克隆 168

3.5.1 鸟枪法 168

3.5.2 cDNA法 172

3.5.3 PCR扩增法 181

3.5.4 化学合成法 187

3.5.5 基因文库的构建 191

4 大肠杆菌基因工程的原理与应用 197

4.1 外源基因在大肠杆菌中的高效表达原理 198

4.1.1 启动子 198

4.1.2 终止子 204

4.1.3 SD序列 205

4.1.4 密码子 206

4.1.5 质粒拷贝数 208

4.2 大肠杆菌工程菌的构建策略 210

4.2.1 包涵体型异源蛋白的表达 211

4.2.2 分泌型异源蛋白的表达 214

4.2.3 融合型异源蛋白的表达 220

4.2.4 寡聚型异源蛋白的表达 223

4.2.5 整合型异源蛋白的表达 230

4.2.6 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 232

4.3 重组异源蛋白的体外复性活化 234

4.3.1 蛋白质变性的动力学原理 234

4.3.2 折叠中间状态分子的集聚作用 235

4.3.3 包涵体的溶解与变性 236

4.3.4 异源蛋白的复性与重折叠 238

4.4 大肠杆菌工程菌培养的最优化控制 244

4.4.1 细菌生长的动力学原理 244

4.4.2 发酵过程的最优化控制 247

4.4.3 生物反应器的选择 250

4.4.4 大规模发酵系统 253

4.4.5 大肠杆菌工程菌的高密度发酵 255

4.5.1 工程菌遗传不稳定性的表现与机制 257

4.5 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 257

4.5.2 改善工程菌不稳定性的对策 259

4.6 利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或多肽 261

4.6.1 重组人胰岛素 262

4.6.2 重组人生长激素 266

4.6.3 重组人干扰素 274

4.6.4 重组人白细胞介素 280

4.6.5 重组人集落刺激因子 286

4.6.6 重组抗体及其片段 287

5 非大肠杆菌的微生物基因工程 300

5.1 芽孢杆菌的重组表达系统 300

5.1.1 芽孢杆菌的克隆载体系统 301

5.1.2 芽孢杆菌的宿主转化系统 305

5.1.3 芽孢杆菌的分泌表达系统 308

5.1.4 重组芽孢杆菌的耐热性酶制剂大规模生产中的作用 310

5.1.5 重组短小芽孢杆菌在人体蛋白药物生产中的应用 314

5.1.6 重组芽孢杆菌在昆虫毒素蛋白生产中的应用 315

5.2 棒状杆菌的重组表达系统 320

5.2.1 棒状菌属的克隆表达系统 320

5.2.2 棒状菌属的宿主转化系统 325

5.2.3 高产氨基酸的工程菌构建战略 326

5.2.4 苏氨酸基因工程菌的构建 329

5.2.5 芳香族氨基酸工程菌的构建 332

5.2.6 赖氨酸工程菌的构建 333

5.3 链霉菌的基历工程 336

5.3.1 链霉菌的载体克隆系统 336

5.3.2 链霉菌的宿主转化系统 342

5.3.3 链霉菌的基因表达调控系统 343

5.3.4 链霉菌的蛋白分泌系统 349

5.3.5 链霉菌抗生素的生物合成机制 354

5.3.6 利用DNA重组技术改良抗生素生产菌的战略 362

5.4 丝状真菌的基因工程 365

5.4.1 丝状真菌的载体克隆系统 365

5.4.2 丝状真菌宿主转化系统 372

5.4.3 丝状真菌的表达分泌系统 373

5.4.4 重组曲霉菌在异源重组蛋白生产中的应用 377

5.4.5 β-内酰胺类抗生素的生物合成机理 378

5.4.6 β-内酰胺类抗生素生产菌的改良 383

5.5 酵母菌的基因工程 384

5.5.1 酵母菌的宿主系统 385

5.5.2 酵母菌的载体系统 389

5.5.3 酵母菌的转化系统 397

5.5.4 酵母菌的表达系统 400

5.5.5 酵母菌的蛋白修饰分泌系统 407

5.5.6 利用重组酵母生产乙肝疫苗 412

5.5.7 利用重组酵母生产人血清白蛋白 414

5.6 其他具有重大经济价值的微生物基因工程 416

5.6.1 用于有机酸醇生产的梭菌属 416

5.6.2 用于乳制品发酵的乳杆菌属 422

5.6.3 用于生物降解的假单孢菌属 424

5.6.4 用于煤脱硫净化处理的硫杆菌属 430

6 高等动物基因工程 433

6.1 动物转基因技术的基本概念 433

6.1.1 动物转基因的效率 433

6.1.2 动物转基因的结构 434

6.1.3 动物转基因的表达特性 434

6.1.4 动物转基因的生物学效应 435

6.2 转基因导入动物体内的方法 436

6.2.1 转基因的动物受体细胞系统 436

6.2.2 动物细胞物理转化法 437

6.2.3 动物病毒转染法 438

6.2.4 工程胚胎干细胞法 445

6.3 利用动物转基因技术研究基因的表达与功能 445

6.3.1 利用转报告基因探测动物基因组的调控序列 447

6.3.2 利用同源基因灭活细胞内源基因 449

6.3.3 利用反义基因抑制细胞基因表达 451

6.4 利用转基因动物或细胞生产生物分子 452

6.4.1 动物细胞高效表达异源蛋白的基本原理 452

6.4.2 利用哺乳动物细胞大规模培养技术生产复杂的人体蛋白 455

6.5 转基因技术在动物遗传性状改良中的应用 457

6.4.3 利用动物乳腺组织生产蛋白药物 457

6.5.1 转基因鼠 458

6.5.2 转基因兔、猪和羊 459

6.5.3 转基因牛 460

6.5.4 转基因鸡 460

6.5.5 转基因鱼 460

6.6 基因治疗 461

6.6.1 基因治疗的基本战略思想 461

6.6.2 肿瘤的基因治疗 463

6.6.3 囊性纤维变性症的基因治疗 465

6.6.4 杜兴肌营养不良症的基因治疗 465

6.6.6 骨髓细胞的转基因研究 467

6.6.7 基因治疗的副反应及其对策 467

6.6.5 重度联合免疫缺陷症的基因治疗 467

7 高等植物基因工程 469

7.1 高等植物的遗传学特性 469

7.2 高等植物的载体转化系统 470

7.2.1 Ti质粒介导的整合转化系统 470

7.2.2 植物病毒介导的转染系统 472

7.2.3 植物细胞的物理转化方法 475

7.2.4 植物原生质体的再生 475

7.3 利用植物转基因技术研究基因的表达与调控 477

7.3.1 利用报告基因展示高等植物的基因表达与调控的信息谱 477

7.3.2 利用转座元件克隆植物基因 477

7.3.3 利用T-DNA构建植物遗传突变株 478

7.4 利用转基因植物生产重组异源蛋白 478

7.5.1 控制果实成熟的转基因植物 480

7.5 转基因技术在植物品种改良中的应用 480

7.5.2 抗虫害的转基因植物 481

7.5.3 抗病毒的转基因植物 481

7.5.4 抗除草剂的转基因植物 484

7.5.5 改变花型花色的转基因植物 484

7.5.6 抗环境压力的转基因植物 484

7.5.7 产生高品质产物的转基因植物 485

8 第二代基因工程 486

8.1 蛋白质工程的基本概念 486

8.1.1 蛋白质工程的基本特征 486

8.1.2 蛋白质工程的研究内容及应用 487

8.2 基因的定向突变 488

8.2.1 局部随机掺入法 488

8.1.3 蛋白质工程实施的必要条件 488

8.2.2 碱基定点转换法 490

8.2.3 部分片段合成法 490

8.2.4 引物定点引入法 490

8.2.5 PCR扩增突变法 495

8.3 蛋白质工程的设计思想 495

8.3.1 引入二硫键以提高蛋白质的稳定性 495

8.3.2 转换氨基酸残基以提高蛋白质的稳定性 498

8.3.3 转换半胱氨酸残基以减少多肽链错误折叠的可能性 498

8.3.4 提高酶的催化活性 499

8.3.5 消除酶的被抑制特性 500

8.3.6 修饰酶的催化特异性 500

8.3.7 强化生长激素与其受体的亲和性 502

8.3.8 构建人源性的单克隆抗体 502