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1 概述 2

1.1 基因工程的基本概念 2

1.1.1 基因工程的基本定义 2

1.1.2 基因工程的基本过程 2

1.1.3 基因工程的基本原理 3

1.1.4 基因工程在生物工程中的地位 3

1.2 基因工程的发展历史 5

1.2.1 基因工程的诞生 5

1.2.2 基因工程的成熟 5

1.2.3 基因工程的腾飞 6

1.3 基因工程的研究意义 7

1.3.1 第四次工业大革命 7

1.3.2 第二次农业大革命 8

1.3.3 第四次医学大革命 8

2 DNA重组克隆的单元操作 12

2.1 DNA重组的载体 12

2.1.1 质粒载体 12

2.1.1.1 质粒的基本特性 12

2.1.1.2 质粒的改造与构建 13

2.1.1.3 质粒的分类及用途 15

2.1.1.4 质粒的分离与纯化 16

2.1.2 λ双链噬菌体DNA载体 17

2.1.2.1 λ噬菌体的生物学特征 17

2.1.2.2 λ-DNA载体的构建 19

2.1.2.3 λ-DNA载体的分类及用途 20

2.1.2.4 λ-DNA的分离与纯化 22

2.1.3 M13单链噬菌体DNA载体 22

2.1.3.1 M13噬菌体的生物学特性 22

2.1.3.2 M13-DNA的改造 23

2.1.4 噬菌体-质粒杂合载体 24

2.1.4.1 黏粒载体 24

2.1.4.2 噬菌粒载体 25

2.1.5 人造染色体载体 26

2.2 DNA的体外重组（切与接） 26

2.2.1 限制性核酸内切酶 26

2.2.1.1 限制性核酸内切酶的发现 26

2.2.1.2 Ⅰ和Ⅲ类限制-修饰酶的基本特征 27

2.2.1.3 Ⅱ类限制性核酸内切酶的基本特征 28

2.2.1.4 甲基化酶的基本特征 31

2.2.2 T4-DNA连接酶 32

2.2.3 其他用于DNA重组的工具酶 32

2.2.3.1 Klenow酶 32

2.2.3.2 末端脱氧核苷酰转移酶 34

2.2.3.3 S1核酸酶 35

2.2.3.4 Bal31核酸酶 35

2.2.3.5 T4-多核苷酸磷酸激酶 36

2.2.3.6 碱性磷酸单酯酶 36

2.2.3.7 T4-DNA聚合酶 36

2.2.4 DNA切接反应的影响因素 36

2.2.4.1 限制性核酸内切酶的切割反应 36

2.2.4.2 T4-DNA连接酶的连接反应 38

2.2.4.3 重组率及其影响因素 38

2.2.5 DNA分子重组的方法 39

2.2.5.1 相同黏性末端的连接 39

2.2.5.2 平头末端的连接 41

2.2.5.3 不同黏性末端的连接 41

2.2.5.4 人工黏性末端的连接 43

2.2.5.5 酶切位点的定点更换 45

2.3 重组DNA分子的转化与扩增（转与增） 47

2.3.1 重组DNA转化的基本概念 47

2.3.2 受体细胞的选择 48

2.3.2.1 限制缺陷型 48

2.3.2.2 重组缺陷型 48

2.3.2.3 转化亲和型 49

2.3.2.4 遗传互补型 49

2.3.2.5 感染寄生缺陷型 49

2.3.3 转化方法 50

2.3.3.1 Ca2＋诱导转化 50

2.3.3.2 PEG介导的细菌原生质体转化 51

2.3.3.3 电穿孔驱动的完整细胞转化 51

2.3.3.4 接合转化 52

2.3.3.5 λ噬菌体的转染 53

2.3.4 转化率及其影响因素 53

2.3.4.1 转化率的定义 53

2.3.4.2 转化率的用途 54

2.3.4.3 转化率的影响因素 54

2.3.5 转化细胞的扩增 55

2.4 转化子的筛选与重组子的鉴定（检） 55

2.4.1 基于载体遗传标记的筛选与鉴定 55

2.4.1.1 抗药性筛选法 56

2.4.1.2 营养缺陷性筛选法 57

2.4.1.3 显色模型筛选法 57

2.4.1.4 噬菌斑筛选法 58

2.4.2 基于克隆片段序列的筛选与鉴定 58

2.4.2.1 PCR鉴定法 58

2.4.2.2 菌落原位杂交法 59

2.4.2.3 限制性酶切图谱法 62

2.4.2.4 亚克隆法 64

2.4.2.5 DNA序列测定法 66

2.4.3 基于外源基因表达产物的筛选与鉴定 71

2.4.3.1 蛋白质生物功能检测法 71

2.4.3.2 放射免疫原位检测法 73

2.4.3.3 蛋白凝胶电泳检测法 73

2.5 目的基因的克隆 75

2.5.1 鸟枪法 75

2.5.1.1 鸟枪法的基本程序 76

2.5.1.2 非随机鸟枪法战略 77

2.5.1.3 鸟枪法克隆目的基因的局限性 78

2.5.2 cDNA法 79

2.5.2.1 mRNA的分离纯化 79

2.5.2.2 双链cDNA的体外合成 81

2.5.2.3 双链cDNA的克隆 83

2.5.2.4 cDNA重组克隆的筛选 85

2.5.3 PCR扩增法 85

2.5.3.1 PCR扩增DNA的基本原理 86

2.5.3.2 PCR扩增产物的克隆 89

2.5.3.3 PCR扩增技术的应用 92

2.5.4 化学合成法 93

2.5.4.1 寡聚核苷酸单链的化学合成 93

2.5.4.2 目的基因的化学合成 95

2.5.5 基因文库的构建 96

2.5.5.1 基因文库的完备性 97

2.5.5.2 基因文库的构建战略 97

2.5.5.3 基因组文库重组克隆的排序 99

2.5.5.4 基因文库的筛选 100

3 大肠杆菌基因工程 104

3.1 外源基因在大肠杆菌中的高效表达原理 104

3.1.1 启动子 104

3.1.1.1 启动子最佳作用距离的探测 104

3.1.1.2 启动子的筛选与构建 104

3.1.1.3 启动子的可控性 106

3.1.1.4 依赖于噬菌体RNA聚合酶的启动子系统 108

3.1.2 终止子 108

3.1.3 SD序列 109

3.1.4 密码子 110

3.1.5 质粒拷贝数 111

3.2 大肠杆菌工程菌的构建策略 113

3.2.1 包含体型异源蛋白的表达 113

3.2.1.1 包含体的性质 113

3.2.1.2 包含体的形成机制 114

3.2.1.3 包含体的分离 115

3.2.1.4 重组异源蛋白表达系统的构建 115

3.2.2 分泌型异源蛋白的表达 118

3.2.2.1 分泌型异源蛋白表达的特性 118

3.2.2.2 蛋白质的传输和分泌机制 118

3.2.2.3 分泌型异源蛋白表达系统的构建 120

3.2.3 融合型异源蛋白的表达 121

3.2.3.1 融合型异源蛋白表达的特性 121

3.2.3.2 融合型异源蛋白表达系统的构建 121

3.2.3.3 异源蛋白从融合蛋白中的回收 123

3.2.4 寡聚型异源蛋白的表达 124

3.2.5 整合型异源蛋白的表达 128

3.2.6 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 129

3.2.6.1 细胞内蛋白质降解的基本特征 129

3.2.6.2 蛋白酶缺陷型受体细胞的改造 130

3.2.6.3 抗蛋白酶的重组异源蛋白序列设计 130

3.3 重组异源蛋白的体外复性活化 131

3.3.1 包含体的溶解与变性 131

3.3.1.1 清洗剂的溶解变性作用 132

3.3.1.2 促溶剂的溶解变性作用 132

3.3.1.3 极端pH的溶解变性作用 133

3.3.1.4 混合溶剂的溶解变性作用 133

3.3.2 异源蛋白的复性与重折叠 133

3.3.2.1 重组异源蛋白纯度对重折叠的影响 133

3.3.2.2 重折叠方法的选择 134

3.3.2.3 二硫键的形成 135

3.3.2.4 折叠辅助蛋白因子的应用 137

3.4 大肠杆菌工程菌培养的最优化控制 138

3.4.1 细菌生长的动力学原理 138

3.4.1.1 分批式发酵 138

3.4.1.2 流加式发酵 139

3.4.1.3 连续式发酵 139

3.4.2 发酵过程的最优化控制 140

3.4.2.1 工程水平的优化控制 140

3.4.2.2 分子水平的优化控制 142

3.4.2.3 细胞水平的优化控制 142

3.4.3 大肠杆菌工程菌的高密度发酵 143

3.4.3.1 高密度发酵培养基的设计 143

3.4.3.2 高密度发酵的温度控制 144

3.4.3.3 高密度发酵的溶氧控制 144

3.5 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 145

3.5.1 工程菌遗传不稳定性的表现与机制 145

3.5.2 改善工程菌不稳定性的对策 146

3.5.2.1 改进载体宿主系统 146

3.5.2.2 施加选择压力 147

3.5.2.3 控制外源基因过量表达 147

3.5.2.4 优化培养条件 148

3.6 利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或多肽 149

3.6.1 胰岛素的结构及其生物合成 149

3.6.2 人胰岛素的生产方法 150

3.6.3 产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略 152

3.6.3.1 AB链分别表达法 152

3.6.3.2 人胰岛素原表达法 152

3.6.3.3 AB链同时表达法 153

4 酵母基因工程 158

4.1 酵母的宿主系统 158

4.1.1 提高重组异源蛋白产率的突变宿主 158

4.1.2 抑制超糖基化作用的突变宿主 159

4.1.3 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主 159

4.1.4 内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主 161

4.2 酵母的载体系统 161

4.2.1 酿酒酵母中的2μ环状质粒 161

4.2.2 乳酸克鲁维酵母中的线状质粒 162

4.2.3 果蝇克鲁维酵母中的环状质粒 163

4.2.4 含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建 163

4.2.5 含有CEN的YCp载体及其构建 164

4.2.6 含有TEL的YAC载体及其构建 164

4.3 酵母的转化系统 166

4.3.1 酵母的转化程序 167

4.3.2 转化质粒在宿主细胞中的命运 167

4.3.3 用于转化子筛选的标记基因 168

4.4 酵母的表达系统 170

4.4.1 酵母启动子的基本特征与选择 170

4.4.2 酵母启动子的可调控表达系统 171

4.4.2.1 温度控制表达系统 171

4.4.2.2 超诱导表达系统 172

4.4.2.3 严紧控制表达系统 173

4.4.3 外源基因在酵母中表达的限制性因素 173

4.4.4 酵母表达系统的选择 174

4.4.4.1 乳酸克鲁维酵母表达系统 174

4.4.4.2 巴斯德毕赤酵母表达系统 175

4.4.4.3 多型汉逊酵母表达系统 177

4.5 酵母菌的蛋白修饰分泌系统 177

4.5.1 蛋白质的分泌运输机制 177

4.5.2 信号肽及其剪切系统 178

4.5.3 分泌型蛋白的糖基化修饰 180

4.6 利用重组酵母生产乙肝疫苗 182

4.6.1 乙肝病毒的结构 182

4.6.2 产乙肝表面抗原的酿酒酵母重组菌的构建 183

4.6.3 产乙肝表面抗原的巴斯德毕赤酵母重组菌的构建 183

4.7 利用重组酵母生产人血清清蛋白 184

5 高等动物基因工程 188

5.1 动物转基因技术的基本概念 188

5.1.1 动物转基因的效率 188

5.1.2 动物转基因的结构 188

5.1.3 动物转基因的表达特性 189

5.1.3.1 转基因的时空特异性表达 189

5.1.3.2 转基因的可控性表达 189

5.1.3.3 转基因的共抑制效应 189

5.1.4 动物转基因的生物学效应 190

5.2 转基因导入动物体内的方法 190

5.2.1 转基因的动物受体细胞系统 190

5.2.2 动物细胞物理转化法 192

5.2.2.1 磷酸钙共沉淀法 192

5.2.2.2 电击法 192

5.2.2.3 脂质体包埋法 192

5.2.2.4 DNA显微注射法 192

5.2.3 动物病毒转染法 193

5.2.3.1 腺病毒 193

5.2.3.2 猴肿瘤病毒 194

5.2.3.3 牛痘病毒 195

5.2.3.4 反转录病毒 196

5.2.4 工程胚胎干细胞法 198

5.2.5 体细胞转基因克隆法 200

5.3 利用动物转基因技术研究基因的表达与功能 200

5.3.1 利用转报告基因探测动物基因组的调控序列 200

5.3.2 利用同源基因灭活细胞内源基因 202

5.3.3 利用Cre-IoxP系统条件性敲除基因 203

5.3.4 利用反义基因抑制细胞基因表达 203

5.3.5 利用干扰RNA阻断特定基因表达 203

5.4 利用转基因动物或细胞生产生物大分子 205

5.4.1 动物细胞高效表达异源蛋白的基本原理 205

5.4.2 利用哺乳动物细胞大规模培养技术生产结构复杂的人体蛋白 207

5.4.3 利用动物乳腺组织生产蛋白药物 207

5.5 转基因技术在动物遗传性状改良中的应用 209

5.5.1 转基因鼠 209

5.5.1.1 转基因鼠在揭示人类分子病病理中的应用 209

5.5.1.2 转基因鼠在研究高等哺乳动物发育机制中的应用 210

5.5.2 转基因兔、猪、羊 210

5.5.3 转基因牛 211

5.5.4 转基因鸡 211

5.5.5 转基因鱼 212

5.6 基因治疗 212

5.6.1 基因治疗的基本战略思想 212

5.6.1.1 基因治疗的基本概念 212

5.6.1.2 基因治疗的基本内容 213

5.6.1.3 基因转移的基本方式 213

5.6.1.4 基因治疗的分子机制 214

5.6.2 肿瘤的基因治疗 214

5.6.2.1 增强肿瘤细胞的免疫原性 215

5.6.2.2 提高人体的免疫机能 215

5.6.2.3 改变癌基因和抑癌基因的表达特性 216

5.6.2.4 修饰肿瘤细胞和正常细胞的药物敏感性 217

5.6.3 囊性纤维变性症的基因治疗 217

5.6.4 杜兴肌营养不良症的基因治疗 218

5.6.5 重度联合免疫缺陷症的基因治疗 218

5.6.6 糖尿病的基因治疗战略 219

5.6.7 骨髓细胞的转基因研究 219

5.6.8 基因治疗的副反应及其对策 220

6 高等植物基因工程 224

6.1 高等植物的遗传学特性 224

6.2 高等植物的基因转移系统 225

6.2.1 Ti质粒介导的整合转化系统 225

6.2.1.1 Ti质粒的分子遗传学特性 225

6.2.1.2 野生型Ti质粒的改造 227

6.2.1.3 Ti质粒介导的共整合转化系统 227

6.2.1.4 Ti质粒介导的二元整合转化系统 228

6.2.1.5 Ti质粒介导的整合转化程序的特点 228

6.2.2 植物病毒介导的转染系统 230

6.2.2.1 植物病毒载体的基本性质 230

6.2.2.2 植物重组病毒的操作战略 232

6.2.2.3 植物病毒介导的转染系统的特点 233

6.2.3 植物细胞的直接转化方法 234

6.2.3.1 植物细胞的物理直接导入法 234

6.2.3.2 植物细胞的化学直接导入法 235

6.2.3.3 植物细胞的生物直接导入法 235

6.2.4 植物原生质体的再生 235

6.3 高等植物的基因表达系统 236

6.3.1 外源基因的四环素诱导系统 237

6.3.1.1 Tc-on型四环素诱导系统 237

6.3.1.2 Tc-off型四环素阻遏系统 238

6.3.2 外源基因的乙醇诱导系统 238

6.3.3 外源基因的类固醇诱导系统 239

6.3.3.1 糖（肾上腺）皮质激素诱导系统 239

6.3.3.2 雌激素诱导系统 239

6.3.3.3 蜕皮激素诱导系统 240

6.3.4 外源基因的地塞米松诱导和四环素抑制系统 241

6.4 利用植物转基因技术研究基因的表达与调控 241

6.4.1 利用报告基因展示高等植物基因表达与调控的信息谱 241

6.4.2 利用病毒载体探查植物基因重排 242

6.4.3 利用转座元件克隆植物基因 242

6.4.4 利用T-DNA构建植物遗传突变株 243

6.5 利用转基因植物生产重组异源蛋白和工业原料 243

6.5.1 利用植物生物反应器生产医用蛋白 243

6.5.2 利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂 245

6.5.3 利用植物生物反应器生产工业原料 245

6.6 转基因技术在植物品种改良中的应用 246

6.6.1 控制果实成熟的转基因植物 246

6.6.2 抗虫害的转基因植物 246

6.6.2.1 含毒晶蛋白编码基因的转基因植物 247

6.6.2.2 含蛋白酶抑制剂编码基因的转基因植物 247

6.6.3 抗病原体的转基因植物 248

6.6.4 抗除草剂的转基因植物 248

6.6.5 改变花型花色的转基因植物 249

6.6.6 抗环境压力的转基因植物 250

6.6.7 产生高品质产物的转基因植物 250

6.6.8 转基因植物的安全性 251

7 第二代基因工程——蛋白质工程 251

7.1 蛋白质工程的基本概念 254

7.1.1 蛋白质工程的基本特征 254

7.1.2 蛋白质工程的研究内容及应用 255

7.1.3 蛋白质工程实施的必要条件 255

7.2 基因的体外定向突变 256

7.2.1 局部随机掺入法 256

7.2.2 碱基定点转换法 257

7.2.3 部分片段合成法 258

7.2.4 引物定点引入法 259

7.2.5 PCR扩增突变法 260

7.3 基因的体外定向进化 262

7.3.1 易错PCR 263

7.3.2 DNA改组 264

7.3.3 体外随机引发重组 266

7.3.4 交错延伸 267

7.3.5 过渡模板随机嵌合生长 267

7.3.6 渐增切割杂合酶生成 268

7.3.7 同源序列非依赖性蛋白质重组 269

7.3.8 突变文库的筛选模型 269

7.4 蛋白质工程的设计思想与应用 271

7.4.1 提高蛋白质或酶的稳定性 271

7.4.1.1 引入二硫键以提高蛋白质或酶的稳定性 271

7.4.1.2 转换氨基酸残基以提高蛋白质或酶的稳定性 272

7.4.2 减少重组多肽链的错误折叠 274

7.4.3 改善酶的催化活性 274

7.4.3.1 转换氨基酸残基以改善酶的催化活性 274

7.4.3.2 随机改组肽段以改善酶的催化活性 275

7.4.3.3 删除末端部分氨基酸序列以改善酶的催化活性 275

7.4.4 消除酶的被抑制特性 276

7.4.4.1 转换氨基酸残基以消除酶的被抑制特性 276

7.4.4.2 删除肽段以消除酶的被抑制特性 277

7.4.5 修饰酶的催化特异性 277

7.4.5.1 共价结合？核苷酸以修饰酶的催化特异性 277

7.4.5.2 转换氨基酸残基以修饰酶的催化特异性 278

7.4.6 强化配体与其受体的亲和性 279

7.4.6.1 随机点突变以强化配体与其受体的亲和性 279

7.4.6.2 基因家族改组以强化配体与其受体的亲和性 281

7.4.7 降低异源蛋白药物的免疫原性 282

8 第三代基因工程——途径工程 286

8.1 途径工程的基本概念 286

8.2 途径工程的研究战略 291

8.2.1 在现存途径中提高目标产物的代谢流 291

8.2.2 在现存途径中改变物质流的性质 293

8.2.3 利用已有途径构建新的代谢旁路 294

8.3 初级代谢的途径工程 296

8.3.1 乙醇生产菌的途径操作 297

8.3.1.1 发酵生产乙醇的基本战略 297

8.3.1.2 酵母属乙醇发酵途径的改良 299

8.3.1.3 高产乙醇的重组大肠杆菌的构建 301

8.3.1.4 直接利用太阳能合成乙醇的光合细菌途径设计 302

8.3.2 辅酶Q生产菌的途径操作 303

8.3.2.1 辅酶Q的生物合成途径 304

8.3.2.2 辅酶Q10的医疗保健功能 305

8.3.2.3 辅酶Q10的大规模产业化现状 307

8.3.2.4 高产辅酶Q10工程菌构建的战略 309

8.3.3 氢气生产菌的途径操作 309

8.4 次级代谢的途径工程 310

8.4.1 聚酮生物合成的分子机制 310

8.4.2 聚酮合酶各组成模件的操作战略 311

8.4.2.1 缺失或增加模件以控制链长 312

8.4.2.2 置换定位结构域以拓宽起始单位的使用范围 312

8.4.2.3 置换酰基转移酶结构域以产生杂合衍生物 312

8.4.2.4 还原环的遗传操作 313

8.4.2.5 人工合酶和聚酮文库的构建 313

8.4.2.6 聚酮内和聚酮间接头的设计 314

8.4.3 聚酮生物合成基因的异源表达 314