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1 了解蛋白质相互作用的意义 1

详细说明 1

背景 3

参考文献 4

2 信号转导和哺乳动物细胞生长：问题及范例 5

前言 5

信号转导框架 6

蛋白质—蛋白质相互作用和信号转导交叉点的调控 8

信号转导和技术——对未来的一种看法 8

参考文献 9

3 蛋白质相互作用技术对肿瘤生物学与药物遗传学的影响 12

序列变异：肿瘤易感性及基于遗传特异型蛋白相互作用的肿瘤治疗 12

遗传危险因子 13

肿瘤与基因组 13

癌基因 15

原癌基因 15

抑癌基因 16

DNA修复基因 17

药物遗传学：当前的状态与未来的目标 20

抗肿瘤治疗的反应 21

运用蛋白质相互作用研究手段去分析遗传变异的功能意义 22

标签融合蛋白 22

免疫共沉淀 22

酵母双杂交 24

荧光共振能量转移技术 24

表面等离子共振技术 25

原子力显微镜技术 25

参考文献 26

结论 26

前言 32

4 用GST融合蛋白鉴定蛋白质—蛋白质相互作用 32

Far western印迹和pull-down技术的优点 33

替代方法，类似范例 33

程序纲要 33

Far western印迹分析 33

GST沉降分析 35

方案 37

方案1：GST融合蛋白的制备 37

方案2：Far western印迹：标记GST融合蛋白 40

方案3：Far western印迹：探测膜 41

方案4：GST沉降 43

参考文献 45

前言 47

5 通过免疫共沉淀法鉴定相互作用蛋白质 47

已知蛋白质间相互作用的检测 48

新蛋白质间相互作用的鉴定 48

程序纲要 48

细胞裂解与免疫沉淀 49

缔合蛋白的检测 49

优化与对照 50

蛋白质鉴定 51

方案 54

方案1：pVHL结合蛋白Cul2的鉴定 54

致谢 56

参考文献 56

前言 60

6 化学交联技术在研究蛋白质相互作用中的应用 60

体内与体外交联反应的区别 61

交联的步骤 62

蛋白质作为交联反应物的作用 62

pH的影响 63

交联剂的类型 63

交联的特异性及选择性 65

交联的特异性及间距（分子标尺及近邻法） 66

一般步骤 66

交联蛋白的纯化及检测 68

可裂变交联剂 69

标记的交联剂 69

高效液相色谱（HPLC）法分析肽图谱 70

质谱法肽制图 70

交联残基的鉴定 70

亲和检测及交联蛋白的纯化 70

交联多肽的亲和纯化 71

参考文献 71

7 研究蛋白质—蛋白质相互作用的酵母和细菌双杂交筛选系统 74

前言 74

方案 75

第一部分：一种基于转录激活的酵母双杂交系统 75

第二部分：一种基于转录激活的细菌双杂交系统 95

致谢 111

参考文献 111

8 利用噬菌体展示技术研究蛋白质—蛋白质相互作用 113

前言 113

噬菌体展示技术的生物学概论 115

程序纲要 115

噬菌体展示技术潜在的局限性 116

关于设计噬菌体展示文库方法的考虑 117

噬菌体展示技术和模建结构域 118

方案 120

方案1：变异结构域文库的制备 120

致谢 130

参考文献 131

9 在出芽酵母中鉴定蛋白质—蛋白质相互作用的遗传学策略 135

前言 135

为什么使用遗传方法 136

程序纲要 137

抑制基因搜寻的准备 137

抑制基因搜寻的实施 139

抑制基因的分析 140

异源体系 141

方案 141

方案1：诱变 141

方案2：酵母菌总DNA的制备 142

方案3：酵母菌的转化 143

参考文献 143

10 研究蛋白质相互作用的FRET显微成像技术 145

前言 146

GFP：对分子和细胞生物学的影响及在蛋白质相互作用研究中的应用 146

荧光共振能量转移 146

程序纲要 149

FRET检测方法 149

受激发射过程测定 149

频率域FLIM数据分析 154

方案 155

方案1：FRET实验 155

致谢 170

参考文献 171

11 绿色荧光蛋白邻近成像法（GFP-PRIM）检测同型蛋白质间相互作用 174

前言 174

FRET检测同型蛋白质间相互作用 175

GFP-PRIM检测同型蛋白质间相互作用 175

PRIM与FRET的差异 176

方案 176

方案1：体外GFP-PRIM：荧光分光光度法测量激发比率 176

方案2：活细胞GFP-PRIM：同型蛋白质相互作用成像 179

结论 181

参考文献 182

12 质谱表征多元蛋白质复合物 183

前言 183

两个复合物研究例子的背景介绍 184

程序纲要 185

制样与样品导入 185

单个蛋白质及其复合物的质谱 186

单个蛋白质及其复合物的电荷状态 188

复合物中亚基的排布 189

蛋白质复合物的热稳定性探测 189

多元蛋白质复合物的实时组装 190

方案 191

方案1：质谱表征多元蛋白质复合物 191

展望 191

参考文献 192

13 用原子力显微技术检测配体—受体间相互作用 194

前言 194

程序纲要 196

AFM仪器 196

AFM在配体—受体相互作用研究方面的应用 197

方案 198

方案1：悬臂功能基化 198

方案2：固定于琼脂糖珠上的配体的AFM检测 199

方案3：活细胞上的AFM测定 200

致谢 202

参考文献 202

前言 205

14 Biacore表面等离子体共振分析相互作用的蛋白质 205

程序纲要 206

传感器芯片 206

芯片表面的再生 208

数据采集 208

动力学检测 209

浓度测定 210

设计方案 210

方案 211

方案1：Biacore表面等离子体共振使用 211

参考文献 219

15 石英晶体微平衡生物传感器在蛋白质相互作用分析中的应用 221

前言 221

程序纲要 223

方案1：石英晶体微平衡分析 224

方案 224

参考文献 228

16 蛋白酶足迹法 230

前言 230

优点与局限 231

蛋白质水解的类型 233

其他方法 234

程序纲要 235

末端标记 235

复合物的组装 237

蛋白质水解 238

断裂位点的鉴定 240

定量分析 240

方案1：利用蛋白激酶A进行末端标记 241

方案 241

方案2：铁－EDTA蛋白酶足迹法反应 242

方案3：利用酶促蛋白酶进行蛋白质水解 244

方案4：Tricine SDS－聚丙烯酰胺蛋白凝胶 245

方案5：通过溴化氰断裂蛋白质所产生的校准梯形条带 246

方案6：通过酶促断裂产生的校准梯形条带 247

参考文献 248

17 串联亲和纯化提高相互作用蛋白质的识别 250

前言 250

标签的选择与设计 251

程序纲要 253

构建表达TAP标签蛋白的细胞或生物体 254

制备提取物 254

串联亲和纯化 255

方案1：制备用于纯化酵母Lsm3蛋白的提取物 256

方案 256

分析纯化后物质 256

对照与确证 256

方案2：利用TAP方法解析蛋白质相互作用 257

参考文献 260

18 逆转循环纯化蛋白质 262

前言 262

程序纲要 264

总述 264

融合蛋白的构建方案 266

ELP标签和ITC条件的选择 266

方案 267

方案1：将ELP组分融合入靶蛋白 267

方案2：从细胞裂解液中纯化ELP融合蛋白 269

方案3：ELP融合蛋白的一般转移循环 271

结论 272

参考文献 272

19 利用体外表达克隆鉴定相互作用蛋白质 273

前言 273

方案 274

方案1：体外表达克隆 274

参考文献 280

20 用蟾蜍卵提取物修饰重组蛋白 281

前言 281

总则 281

用细胞提取液作为模型系统 282

蟾蜍卵提取物模型系统 283

程序纲要 283

蟾蜍卵提取物的制备 284

重组蛋白的修饰和再分离 285

修饰评价和修饰蛋白的利用 286

对照 288

方案 289

方案1：卵提取 289

方案2：修饰、再分离和评价 291

方案3：质谱 293

致谢 294

参考文献 294

21 采用λ阻遏物融合技术分离和鉴定自组装结构域 297

前言 297

程序纲要 299

文库的构建 300

挑选和筛选 303

自组装结构域的鉴定 305

寡聚化状态的检测 305

方案 306

方案1：λ阻遏物融合 306

致谢 310

参考文献 311

22 基于膜的酵母双杂交体系 314

前言 314

酵母双杂交体系的局限性 315

非传统的酵母双杂交体系——研究膜蛋白相互作用的工具 315

筛选与NubG融合的cDNA库 319

酵母S.cerevisiae膜蛋白相互作用的基因组范围的分析 319

基于膜的酵母双杂交体系应用展望 319

基于膜的酵母双杂交筛选与药物设计 320

基于膜的酵母双杂交体系的优点和缺点 320

致谢 322

参考文献 322

23 β－半乳糖苷酶互补实验对活细胞中蛋白质间相互作用的检测 324

前言 324

背景 325

程序纲要 327

构建和表达融合蛋白的策略 327

检测β-gal活性的方法 329

方案 330

方案1：逆转录病毒的准备与靶细胞的转染 330

方案2：化学发光法检测β-gal的活性 331

方案3：流式细胞法检测β-gal的活性 332

方案4：X-Gal实验检测β-gal的活性 333

方案5：荧光－X-Gal实验检测β-gal的活性 334

参考文献 336

24 双杂交系统研究胞内蛋白质和单链抗体的相互作用 338

前言 338

应用酵母双杂交系统检测胞内单链抗体与抗原相互作用 340

应用酵母双杂交系统筛选单链抗体文库 342

双诱饵酵母双杂交系统一步法鉴定两种不同的单链抗体—抗原相互作用 342

哺乳动物细胞双杂交系统评价单链抗体和蛋白质在胞内的相互作用 345

程序纲要 346

方案 346

方案1：检测单链抗体—蛋白质相互作用的酵母双杂交系统 346

方案2：哺乳动物细胞瞬时转染实验 353

参考文献 354

致谢 354

25 利用蛋白质片段互补策略研究蛋白质相互作用和文库筛选 357

前言 357

程序纲要 359

基本概念 359

DHFR蛋白质片段互补分析（PCA） 360

以新霉素和潮霉素B为基础的PCA 362

TEM β－内酰胺酶PCA 362

PCA研究的控制标准 363

在细菌体内应用DHFR PCA方法库对库筛选相互作用的蛋白质 363

方案 365

方案1：细菌DHFR PCA存活分析 365

方案2：在体内进行库对库的筛选相互作用蛋白质：细菌中进行代谢竞争选择 365

方案3：哺乳动物细胞DHFR PCA存活分析 366

方案4：哺乳动物细胞DHFR PCA荧光分析 367

方案5：GFP PCA荧光分析 369

方案6：体外β－内酰胺酶PCA比色分析 370

方案7：体内β－内酰胺酶PCA酶活分析 371

方案8：新霉素和潮霉素B存活分析 373

参考文献 374

26 基于cAMP信号级联的一种细菌双杂交系统 376

前言 376

以细菌腺苷酸环化酶为基础的双杂交系统原理 377

程序纲要 378

杂合蛋白的表达载体 379

细菌菌株 380

方案1：功能互补的数量测定 381

方案 381

筛选相互作用子 381

试验细菌的转化 381

选择表达相互作用杂合蛋白的细胞 381

结论 384

参考文献 385

27 肽适配子与蛋白质功能和蛋白质网络系统研究 387

前言 387

肽适配子作为表型分析试剂 388

应用酵母双杂交系统选取肽适配子 389

双杂交系统中应用的随机肽库 391

筛选随机肽库的双杂交策略 393

肽适配子获取方法改进 394

调节子和干扰子分析法 396

竞选高效作用的肽适配子 397

参考文献 398

检验肽诱导表型的特异性 398

结论 398

28 用渐增截断方法产生蛋白质片段文库 402

前言 402

程序纲要 403

基本概念 403

渐增截断用载体的描述 405

方案 405

方案1：渐增截断 405

结论 414

参考文献 414

29 蛋白质家族的新成员——催化抗体 416

前言 416

天然催化抗体 417

人工抗体酶的设计和潜能 417

抗体固有催化活性的质量控制标准 419

高催化活性的天然抗体酶的分离 420

抗体酶机制的研究 421

结论 422

参考文献 422

30 通过核糖体展示进行蛋白质—配体相互作用的体外筛选和进化 427

前言 428

核糖体展示的原理 428

核糖体展示的应用 429

程序纲要 430

用于核糖体展示的构建组分 430

核糖体展示构建组分的制备 431

用大肠杆菌S30细胞提取物进行体外翻译 432

体外转录 432

亲和筛选 433

通过适应筛选压力剪切分子 433

从筛选到进化 434

DNA文库和单克隆的RIA分析 434

核糖体展示的优化 435

方案 435

方案1：通过连接制备核糖体展示构建组分 435

方案2：体外转录及mRNA的纯化 437

方案3：大肠杆菌S30细胞提取物的制备 439

方案4：体外翻译 440

方案5：亲和筛选 441

方案6：mRNA的纯化和RT-PCR 443

方案7：进化：引入额外的多样性 445

方案8：核糖体复合物与游离蛋白质及小分子化合物的分离 446

方案9：放射免疫分析（RIA） 446

方案10：Northern印迹 447

参考文献 448

31 用膜上肽合成的方法分析蛋白质相互作用 451

前言 451

相互作用研究的肽合成策略 452

结合反应伴侣的检测 453

程序纲要 453

方案 455

方案1 455

参考文献 459

前言 461

32 蛋白成束增强蛋白质—蛋白质相互作用检测 461

双杂交相互作用 462

双杂交实验存在的问题 462

蛋白成束对双杂交实验灵敏性的加强：应用于哺乳动物细胞 462

杂交蛋白成束在双杂交实验中的优点 464

程序纲要 467

DNA结合结构域和DNA结合结构域融合蛋白 467

激活结构域和激活结构域融合蛋白 467

成束结构域 468

报告基因和报告质粒 468

细胞系 468

对照 469

方法 469

致谢 469

参考文献 469

33 用计算方法分析全基因组蛋白质相互作用 472

前言 473

从基因组到后基因组 473

发现全基因组蛋白质相互作用的问题 473

软方法：纯计算 475

种系发生谱 475

基因簇 477

基因融合 477

中间方法：计算与实验 478

代谢重组 479

转录谱 480

硬方法：纯实验 480

注释（Curated）数据库 480

文本挖掘 481

生物学家的计算资源 482

纯直系同源和种系发生谱 483

基因共定位 483

基因融合分析 485

代谢网络和调控通路 487

基因表达分析方法 490

包含相互作用信息的数据库 491

相互作用蛋白质数据库 491

生物专业数据库 491

参考文献 492

34 蛋白质—蛋白质相互作用的可视化和整合 496

前言 497

为什么需要可视化 497

蛋白质相互作用图与代谢途径 498

蛋白质网络、蛋白质复合物和动态的蛋白质相互作用 498

蛋白质—蛋白质相互作用和相关的信息 499

可视化 500

关系的可视化 500

符号和规则 503

图形和图形的绘制 504

弹簧镶嵌体算法 505

大型图形的局限性 505

扩展到三维空间 505

可视化技术 505

利用补充数据整合蛋白质相互作用网络 508

补充数据类型的同时显示 508

实例：研究半乳糖代谢的整合网络 508

信使RNA和蛋白质表达信息的添加引起的网络改变 509

整合网络拓展了生物学的视野 510

图形描述的选择 512

从可视化描述到一个预测模型：利用物理相互作用网络来进行基因表达建模的早期步骤 513

预测对半乳糖利用网络的某些扰动导致的表达变化 513

将来研究方向 514

参考文献 515

35 通过调节蛋白质—蛋白质之间相互作用发展新的治疗方法 518

前言 518

靶向性转录 518

可诱导的转录 522

病毒载体的重定向 524

总结 525

参考文献 525

附录1 注意事项 531

附录2 供应商 539

索引 540