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第一章 绪论 1

第一节 组织培养的诞生与发展简史 1

第二节 组织培养的优点、局限性及发展方向 4

一、组织培养的优点 4

二、组织培养的局限性 5

三、组织培养的可能发展方向 6

第三节 组织培养常用术语 6

第四节 组织培养常用缩写词 9

第二章 培养基 12

第一节 培养基的基本性质 12

一、营养成分 12

二、促生长因子及激素 12

三、渗透压 13

四、pH 13

五、无毒、无污染 13

第二节 天然培养基 13

一、血清 13

二、鼠尾胶原 16

三、组织浸出液 17

第三节 合成培养基 17

一、基本培养基 17

二、无血清培养基 22

三、无蛋白培养基和限定化学成分培养基 24

第四节 其他培养用液 24

一、平衡盐溶液 24

二、消化液 25

三、pH调整液 25

四、抗生素液 25

五、谷氨酰胺补充液 26

第三章 细胞培养的基本条件 27

第一节 细胞培养实验室的建立 27

一、实验室设计原则与要求 27

二、实验室的布局 27

三、细胞培养实验室的基本设备 29

第二节 培养仪器和材料 31

一、常用仪器设备 31

二、培养器皿与其他材料 34

三、培养器皿的清洗和消毒 35

第三节 培养用液 41

一、培养基 41

二、其他培养用液 52

三、培养用液的灭菌与保存 54

第四章 细胞培养的基本技术 58

显微镜观察和流式细胞术 58

一、相差显微镜 58

二、荧光显微镜 60

三、激光共聚焦扫描显微镜 62

四、流式细胞仪 65

第五章 体外培养的基本组织 69

第一节 上皮组织 69

一、内皮细胞的培养 69

二、单层柱状上皮细胞的培养 75

三、假复层纤毛柱状上皮细胞的培养 76

四、复层扁平上皮细胞的培养 78

第二节 结缔组织 81

一、成纤维细胞的培养 81

二、巨噬细胞的培养 82

三、脂肪细胞的培养 84

四、肥大细胞的培养 86

五、血细胞的培养 88

六、淋巴细胞的培养 90

七、软骨细胞的培养 91

八、骨细胞的培养 93

第三节 肌组织 94

一、心肌细胞的培养 94

二、平滑肌细胞的培养 95

三、骨骼肌细胞的培养 97

第四节 神经组织 98

一、神经元的培养 98

二、神经胶质细胞的培养 99

第五节 细胞运动的观察 102

一、噬动轨迹法 102

二、细胞刮除法 103

三、细胞培养池法 103

四、数字影像法 104

第六节 细胞培养的生长测定 104

一、细胞计数法 104

二、台盼蓝染色法 105

三、MTT比色法 106

四、细胞生长曲线法 106

五、［3H］-TdR掺入法 107

六、BrdU掺入法 108

第七节 细胞的冻存、复苏和运输 109

一、细胞的冻存 109

二、细胞的复苏 110

三、细胞的运输 110

第六章 细胞建系和鉴定 112

第一节 正常细胞系的建立和鉴定 112

一、正常细胞系建立程序 113

二、正常细胞系建立的例证 117

三、正常细胞系的鉴定 119

第二节 癌细胞系、转化细胞系的建立和鉴定 124

一、癌细胞系的建立 124

二、癌细胞建系的例证 126

三、转化细胞系建立 127

四、癌细胞和转化细胞建系讨论和小结 128

五、癌细胞系和转化细胞系的鉴定 128

六、癌细胞和转化细胞系建立和鉴定的小结和讨论 133

第七章 细胞周期分析与细胞克隆化技术 135

第一节 细胞周期概述 135

第二节 细胞周期调控 136

第三节 细胞同步化方法 138

一、使细胞同化在G0/G1期方法 138

二、使细胞同步化在G1期 139

三、使细胞同步化在G1/S期交界点 140

四、使细胞同步化在有丝分裂期（M期） 140

第四节 细胞周期分析 141

一、流式细胞仪分析细胞周期 141

二、［3H］-TdR掺入DNA法 141

三、BrdU掺入法 142

四、PCNA法 142

五、Ki-67法 142

六、测定细胞周期的其他方法 142

第五节 细胞克隆的概念及培养方法 144

一、细胞克隆的基本概念 144

二、细胞克隆的培养方法 145

第八章 器官培养 147

第一节 器官培养的要求 147

一、器官培养的取材 148

二、培养基 148

三、培养环境中的气体 149

四、培养器官的支持物 149

第二节 器官培养技术的特点 149

一、优点 149

二、不足 150

第三节 器官培养的方法 150

一、固体培养基器官培养法 150

二、液体培养基器官培养法 152

三、动态器官培养法 155

四、体内器官培养法 157

第四节 器官培养的应用 159

一、器官培养在胚胎发育研究中的应用 159

二、器官培养在器官功能及其代谢研究中的应用 163

三、器官培养在肿瘤侵袭研究中的应用 167

第九章 干细胞的培养 171

第一节 胚胎干细胞 171

一、胚胎干细胞的培养 172

二、胚胎干细胞的形态特征及其鉴定 177

第二节 神经干细胞 178

一、神经干细胞的概念及生物学特征 178

二、神经干细胞的分离与培养 179

第三节 造血干细胞 182

一、造血干细胞的定义及生物学特征 182

二、造血干细胞的分离及培养 182

第四节 间充质干细胞 184

一、从骨髓细胞中分离MSC细胞 184

二、流式细胞仪分离鉴定MSC 184

三、MSCs克隆形成试验 185

四、人的MSC细胞系培养 185

五、MSC细胞向脂肪细胞谱系分化 185

六、MSC诱导分化为软骨细胞——软骨细胞团试验 186

七、MSC诱导分化为成骨细胞谱系 186

第五节 表皮组织干细胞 187

一、移植人皮肤培养表皮干细胞 188

二、角质形成细胞的鉴定 188

第六节 胰岛干细胞 189

一、从人胰腺制备胰岛干细胞 189

二、从小鼠胚胎干细胞系定向诱导分化为胰岛干细胞 190

第七节 鉴定干细胞及分化细胞类型的标志 191

第八节 体细胞重编程为多能干细胞 194

一、细胞培养 195

二、质粒构建 195

三、慢病毒制备及感染 196

四、4种转录因子的反转录病毒感染人成纤维细胞诱导产生iPS细胞 196

五、人iPS细胞的鉴定 196

第十章 细胞培养在细胞分化研究中的应用 201

第一节 细胞分化概念 201

一、细胞分化的特征 201

二、细胞分化的调控 202

三、细胞分化的分子机制 203

四、细胞分化的调控障碍与疾病 204

第二节 正常细胞的分化研究 205

一、正常细胞分化研究简况 205

二、ES和EG细胞培养和建系的基本技术 206

三、ES细胞体外诱导分化 209

四、诱导分化细胞的永生化 212

五、小鼠骨髓和脾来源树突状细胞的分离与扩增培养 213

第三节 癌细胞分化研究 215

一、癌细胞分化研究的简况 215

二、癌细胞分化研究 215

三、癌细胞分化研究几种常用的检测技术 222

第十一章 细胞培养在细胞衰老、凋亡研究中的应用 225

第一节 细胞凋亡的常用研究方法 225

一、细胞凋亡的形态学研究方法 225

二、细胞凋亡的生物化学研究方法 228

三、细胞凋亡的免疫化学分析方法 231

四、细胞凋亡的分子生物学研究方法 233

五、细胞凋亡时Ca2＋浓度测定 236

第二节 抗凋亡研究 237

一、bcl-2基因的抗凋亡作用 237

二、细胞抗凋亡的信号转导通路 238

第三节 细胞衰老的常用研究方法 239

一、衰老相关β-半乳糖苷酶活性检测 239

二、端粒长度的测定 240

三、错配修复基因的测定 241

四、微卫星不稳定性的测定 242

第十二章 细胞融合与单克隆抗体制备 244

第一节 单克隆抗体制备的基本原理 245

第二节 小鼠-小鼠B淋巴细胞杂交瘤 247

一、融合用细胞的制备 247

二、细胞融合 250

三、杂交瘤细胞的选择培养 251

四、特异抗体的检测 252

五、杂交瘤细胞的克隆化 254

六、杂交瘤细胞的冻存 255

七、单克隆抗体的大量制备 256

八、单克隆抗体Ig类型的鉴定 256

九、小鼠单克隆抗体的纯化 257

第三节 人-人淋巴细胞杂交瘤与人-鼠杂交瘤细胞 259

一、人-人淋巴细胞杂交瘤技术 259

二、人-小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术 261

第四节 大鼠-大鼠B淋巴细胞杂交瘤 261

一、大鼠骨髓瘤细胞系 261

二、大鼠B淋巴细胞的制备 261

三、细胞融合 262

四、大鼠单克隆抗体的生产 262

五、大鼠单克隆抗体的提纯 262

第五节 基因工程抗体 262

一、人-鼠嵌合抗体 262

二、小分子抗体 263

三、双特异性抗体 263

四、噬菌体抗体 264

第十三章 细胞培养的应用 267

第一节 细胞培养在分子生物学中的应用 267

一、分离提取研究 267

二、基因导入 272

三、原位检测研究 277

第二节 细胞培养在生物工程中的应用 279

一、大规模细胞培养的体系参数 280

二、大规模细胞培养的工艺类型 280

三、大规模细胞培养方法 281

第三节 细胞培养在生物制品中的应用 284

一、生物制品的概念 284

二、细胞培养在疫苗制备中的应用 284

第四节 细胞培养在药物开发中的应用 286

第五节 细胞培养在临床中的应用 293

一、细胞培养在临床诊断中的应用 293

二、细胞培养在临床治疗中的应用 295

第十四章 细胞毒性 301

第一节 存活率 302

一、染料排斥法测定细胞存活率 302

二、染料摄取法测定细胞存活率 302

三、中性红摄取法 303

第二节 生存力 303

第三节 代谢性细胞毒测定 305

第四节 转化和诱变 307

第五节 刺激性 309

第十五章 细胞培养常见问题解答 311

第一节 细胞培养相关问题 311

一、细胞培养开始前的准备工作 311

二、所需细胞从何处引进／订购 311

三、如何准备细胞培养的用品 311

第二节 细胞培养液使用相关问题 312

一、细胞培养时应使用哪种培养基 312

二、液体培养基的保存应该冷藏还是冷冻 312

三、细胞培养液中是否需要添加谷氨酰胺 312

四、培养用液pH对细胞生长有什么影响 312

五、为什么培养液pH变化太快 312

六、培养液出现沉淀时pH是否会发生变化 313

七、培养细胞所用培养液需要的渗透压 313

八、培养基在使用过程中应注意的问题 313

九、为什么MEM需加NEAA 313

十、为什么有的细胞需要丙酮酸钠？如何向培养液中添加 314

十一、为什么有的细胞需要添加胰岛素 314

十二、培养液中可以使用HEPES吗 314

十三、培养液为何需避光保存 314

十四、有没有培养液培养时不需要CO2孵箱 314

十五、抗生素的使用方法 314

第三节 细胞培养血清使用常见问题 314

一、血清的级别 314

二、血清的最佳化冻方式 315

三、血清化冻后为什么是浑浊的 315

四、胎牛血清的替代品 315

五、血清为何要灭活 315

六、血清灭活的正确方法 315

第四节 细胞传代常见问题 315

一、培养细胞何时需传代？多长时间传一次 315

二、单层贴壁细胞如何传代 316

三、细胞传代消化时所用胰蛋白酶浓度越高越好吗 316

四、传代后培养细胞不贴壁的原因 316

五、悬浮培养细胞如何传代 316

六、悬浮培养细胞如何换液 316

七、悬浮细胞为什么成团 316

八、原代细胞培养物污染的原因 317

九、培养细胞生长减慢的原因 317

十、培养细胞死亡的原因 317

十一、如何将单层贴壁生长细胞驯化为悬浮培养细胞 317

十二、细胞培养适用的CO2浓度 318

十三、实验室没有现成的细胞所需培养基，是否可以换为另一种培养基 318

第五节 细胞及培养液质量检测相关问题 318

一、为什么有些细胞没有传代数 318

二、细胞培养应检测的微生物 318

三、如何筛查支原体污染 318

四、支原体污染的细胞能否去除支原体 318

第六节 细胞冻存复苏相关问题 319

一、没有程序冻存仪的情况下如何保证最优冷冻速度 319

二、在液氮中冻存细胞能保存多久 319

附录Ⅰ 实验室常用的细胞系（株） 320

附录Ⅱ-1 常用缓冲液 322

附录Ⅱ-2 其他缓冲液的配制 323

附录Ⅲ 常用人工合成细胞培养基 325

附录Ⅳ 细胞培养常用英语词汇 326

英中文对照索引 333