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绪论 1

第1章 基因与基因工程 13

1.1 基因 13

1.1.1 基因的基本结构特征 14

1.1.2 基因表达调控 17

1.1.3 基因打靶与基因沉默 33

1.2 基因工程 35

1.2.1 基因工程定义 36

1.2.2 基因工程工具酶 36

1.2.3 基因克隆载体 38

1.2.4 基因工程基本操作步骤 52

1.2.5 基因工程历史 54

1.2.6 基因工程应用 55

第2章 动物克隆技术和理论 63

2.1 动物克隆技术发展简介 63

2.1.1 动物胚胎分割技术 63

2.1.2 动物细胞核移植技术 64

2.2 动物克隆技术的基本原理 66

2.2.1 胚胎分割的基本原理 66

2.2.2 细胞核移植的基本原理 67

2.3 动物克隆技术 67

2.3.1 显微操作器械 67

2.3.2 胚胎分割 68

2.3.3 细胞核移植 69

2.4 动物克隆理论 75

2.4.1 受体胞质对供体核的重编程 76

2.4.2 核质互作 81

2.4.3 核移植的线粒体问题 81

2.4.4 哺乳动物的表观遗传学调控 82

2.4.5 DNA甲基化与动物克隆 87

2.4.6 基因组印记与动物克隆 91

2.5 小结 97

第3章 动物转基因技术 98

3.1 动物转基因技术和克隆技术的区别 98

3.2 动物转基因技术 98

3.2.1 原核期胚胎的显微注射技术 99

3.2.2 逆转录病毒载体侵染技术 99

3.2.3 慢病毒载体技术 100

3.2.4 精子载体技术 101

3.2.5 体细胞核移植技术 102

3.2.6 ES细胞介导技术 105

3.2.7 胞内单精注射技术 106

3.2.8 受体介导的基因转移 106

3.3 动物转基因新技术研究进展 107

3.3.1 PGCs技术 107

3.3.2 精原干细胞法 108

3.3.3 基因打靶技术 108

3.3.4 RNA干扰（RNAi）介导的基因沉默技术 113

3.3.5 诱导多能干细胞转基因技术 114

3.3.6 人工染色体法 116

3.3.7 双顺反子条件表达转基因系统法 119

3.3.8 问题与展望 119

3.4 外源重组基因导入动物细胞的其他方式 121

3.4.1 电穿孔法 121

3.4.2 基因枪法 121

3.4.3 超声波法 122

3.4.4 磷酸钙或DEAE-葡聚糖转染法 122

3.4.5 脂质体介导转化法 122

3.4.6 动物病毒介导转导法 122

3.5 提高转基因效率的策略 123

3.5.1 外源基因的整合机制 123

3.5.2 转基因表达载体的构建 126

3.6 转基因技术存在的问题 130

3.6.1 成本高、整合效率总体比较低 130

3.6.2 转基因表达水平低 130

3.6.3 难以控制转基因在宿主基因组中的行为 131

3.6.4 目的基因与动物生产性状的多基因矛盾突出 131

3.6.5 转基因动物及其产品的安全性问题 131

第4章 目的基因的分离 133

4.1 核酸的制备 134

4.1.1 DNA的制备 134

4.1.2 RNA的制备 135

4.1.3 人工合成核酸片段 135

4.1.4 核酸样品的分析与检测 136

4.2 基因文库的构建 139

4.2.1 原核生物基因组文库的构建 140

4.2.2 真核生物基因组文库的构建 142

4.2.3 cDNA基因文库的构建 146

4.3 目的基因的分离 153

4.3.1 从基因文库中筛选分离目的基因 153

4.3.2 利用聚合酶链反应技术扩增目的基因 158

4.3.3 利用差示分析法分离目的基因克隆 163

4.3.4 应用基因定位克隆技术分离筛选目的基因 164

4.3.5 标签测序法分离目的基因 165

4.3.6 基因的酶法合成 168

第5章 转基因细胞的制备 170

5.1 受体细胞的类型 171

5.1.1 原核受体细胞 171

5.1.2 丝状真菌受体细胞 171

5.1.3 酵母受体细胞 172

5.1.4 动物受体细胞 172

5.2 重组基因导入原核受体细胞的主要途径 174

5.2.1 转化 174

5.2.2 转导 174

5.2.3 转染 175

5.2.4 电穿孔 175

5.2.5 三亲本杂交 176

5.3 重组基因导入动物受体细胞 176

5.4 重组子筛选 177

5.4.1 遗传表型直接筛选 177

5.4.2 依赖于重组子结构特征分析筛选 181

5.4.3 核酸分子杂交分析 182

5.4.4 免疫化学分析检测 191

5.4.5 PCR筛选法 194

5.5 转基因细胞的检测 195

5.5.1 目的基因的整合检测 195

5.5.2 目的基因的表达检测 197

5.5.3 其他检测 201

5.5.4 转基因细胞的核型分析 202

第6章 卵母细胞体外成熟 204

6.1 卵母细胞发育生物学特性 204

6.1.1 卵泡发育和排卵 205

6.1.2 卵母细胞卵膜的发生发育 207

6.1.3 卵泡细胞在卵母细胞发育中的作用 207

6.1.4 卵母细胞发育及成熟过程中超微结构的变化 207

6.2 卵母细胞体外成熟 210

6.2.1 卵母细胞体外成熟培养概况 211

6.2.2 卵母细胞成熟的机理 211

6.2.3 卵母细胞成熟培养 214

6.2.4 影响卵母细胞体外成熟的因素 219

第7章 胚胎体外培养和冷冻保存 225

7.1 胚胎体外培养 225

7.1.1 简单化学限定培养液 225

7.1.2 共同培养系统 226

7.1.3 添加肽类生长因子的培养系统 227

7.1.4 早期胚胎体外发育的影响因素 228

7.2 胚胎冷冻保存 230

7.2.1 胚胎冷冻保存的发展简史 230

7.2.2 胚胎冷冻保存的意义 232

7.2.3 胚胎冷冻的基本原理 232

7.2.4 胚胎冷冻及解冻的基本方法 238

7.2.5 胚胎冷冻效果的鉴定 245

第8章 转基因克隆胚胎移植与附植 247

8.1 胚胎移植 247

8.1.1 胚胎移植概述 247

8.1.2 转基因克隆胚胎移植的准备 251

8.1.3 受体的同期发情 253

8.1.4 转基因克隆胚胎移植 257

8.2 附植 262

8.2.1 胚泡迁移、定位和植入 262

8.2.2 附植中的妊娠识别及其机理 263

第9章 转基因动物的检测和安全性评价 266

9.1 转基因动物的检测 266

9.1.1 外源基因存在的检测 266

9.1.2 外源基因拷贝数的检测 266

9.1.3 外源基因整合位点数的检测 268

9.1.4 外源基因整合位点基因组序列的检测 268

9.1.5 转基因表达的检测 269

9.1.6 转基因动物检测中存在的问题和展望 270

9.2 转基因动物的安全性评价 271

9.2.1 转基因动物安全性检测的内容和方式 271

9.2.2 转基因动物研究及其产品的安全性评价 273

9.2.3 转基因动物食品的安全性评价 278

参考文献 286