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目 录 1

谈序 1

第一章载体—宿主系统 1

质粒 1

施序 2

译者的话 3

前言 4

用质粒进行的克隆 8

λ噬菌体 11

裂解性生长周期 14

溶源性 15

λ噬菌体载体的构建 16

合适载体的选择 17

λ噬菌体载体的图谱 18

柯斯质粒 36

单链噬菌体 40

小结 42

第二章 细菌菌株和病毒的增殖与保存 44

菌株的鉴定 44

单菌落的分离 44

细菌菌株的生长、保持和保藏 46

λ噬菌体噬斑的纯化 46

从单噬斑制备λ噬菌体纯种 47

液体培养基 49

培养基和抗生素 49

含琼脂或琼脂糖的培养基 50

抗生素 51

第三章λ噬菌体和质粒DNA的分离 53

λ噬菌体的大量制备 53

感染 53

诱导（Pirrotta et al.,1971） 54

λ噬菌体的纯化（Yamamoto et al.,1970） 55

λ噬菌体DNA的抽提 58

质粒DNA的大量分离 58

细菌的生长和质粒的扩增 59

细菌的收集和裂解 59

用氯化铯—溴化乙锭等密度平衡离心和提纯闭环DNA 61

质粒DNA制剂中RNA的去除 62

第四章用于分子克隆的酶 64

限制性内切酶 64

同切口限制性内切酶 64

甲基化作用 67

用限制性核酸内切酶酶切DNA 68

用于分子克隆的其他酶类 69

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 70

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段 73

T4 DNA聚合酶 75

用T4多核苷酸激酶标记DNA5′末端 78

依赖于RNA的DNA聚合酶 82

DNA的去磷酸化 84

核酸酶Bal31 85

SI核酸酶 88

绿豆核酸酶（绿豆种子） 88

核糖核酸酶 88

脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ） 89

核酸外切酶Ⅶ 89

核酸外切酶Ⅲ 90

λ核酸外切酶 91

Poly（A）聚合酶 91

T4 DNA连接酶 92

T4 RNA连接酶 92

脱氧核糖核苷末端转移酶（末端转移酶） 93

EcoRI甲基化酶 93

第五章 凝胶电泳 95

琼脂糖凝胶电泳 95

凝胶电泳槽 96

缓冲液 98

琼脂糖凝胶的制备 98

琼脂糖凝胶中DNA的染色 100

照相 102

微型凝胶电泳 102

琼脂糖凝胶中DNA的回收 102

碱性琼脂糖凝胶 105

聚丙烯酰胺凝胶电泳 106

聚丙烯酰胺凝胶的制备 107

聚丙烯酰胺凝胶中DNA片段的分离（Maxam and Gilbert 1977） 109

链分离凝胶 109

聚丙烯酰胺凝胶中的链分离 110

琼脂糖凝胶中DNA的链分离 111

用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行短双链DNA的链分离 111

第六章真核细胞中mRNA的抽提、纯化与分析 114

哺乳动物细胞中mRNA的分离 115

细胞总RNA的分离 117

Poly（A）+RNA的筛选 118

RNA凝胶电泳 119

RNA的核酸酶－S1酶切制图法 123

cDNA第一链的合成 125

cDNA的合成 125

第七章 cDNA的合成与克隆 125

cDNA第二链的合成 127

发夹环的核酸酶S1切割 127

双链cDNA的分子克隆 127

同聚尾接法 128

DNA接头的合成 129

cDNA克隆的其他方法 130

cDNA克隆的策略 132

高丰度mRNAs 132

低丰度mRNAs 132

cDNA的克隆程序 135

双链cDNA的合成 135

用核酸酶S1的酶切 138

双链cDNA的克隆 140

载体和双链cDNA的退火 142

双链cDNA克隆的顺序添加接头法 142

第八章质粒和λ噬菌体DNA引入大肠杆菌 145

质粒DNA在大肠杆菌中的转化 145

用氯化钙转化的程序 145

用氯化钙／氯化铷转化的程序 146

大肠杆菌x1776的转化 147

λ噬菌体DNA的体外包装 148

λ噬菌体溶源菌的保存和检测 149

包装提取物的制备方法Ⅰ 150

体外包装方法Ⅰ 151

包装抽提物的制备方法Ⅱ 152

体外包装方法Ⅱ 154

第九章 基因库的构建 155

用λ噬菌体作载体构建基因库 155

载体DNA的制备 157

用组织培养细胞分离高分子量的真核DNA(Blim and Stafford 1976) 160

真核DNA20kb片段的制备 161

连接和包装 163

基因库的扩增 167

用柯斯载体构建基因库 167

用经磷酸酶处理的柯斯载体进行的克隆 168

用两种限制酶酶切和磷酸酶处理的柯斯载体进行的克隆 170

柯斯质粒基因库的扩增、保存及筛选 173

细菌菌落和噬菌体的原位杂交 176

第十章重组克隆系的鉴定 176

少量细菌菌落的筛选 177

菌落在硝酸纤维素滤膜上的影印 178

杂交筛选λ噬菌斑（Benton and Davis 1977） 180

λ噬菌斑原位扩增后的杂交筛选 181

固定于滤膜的DNA或RNA与放射性探针杂交 182

印染在硝酸纤维素滤膜上的噬菌斑或菌落杂交 183

用杂交筛选鉴定cDNA克隆株 184

利用固定于硝酸纤维素滤膜上的DNA进行杂交选择 185

杂交选择的RNA在网质红细胞裂解物中的翻译 190

注入蛙卵母细胞内mRNA的翻译 193

重组选择的原理 195

通过大肠杆菌细胞内重组筛选λ噬菌体基因库中特定的DNA序列 195

用于πVX质粒筛选的菌株 197

πVX的制备 198

W3110r-m+（P3）的转化 198

将λ噬菌体基因库涂布于W3110r-m+（P3）（πVX）菌 198

含有抑制基因噬菌体的遗传学检测法 198

πVX系统的检测 198

πVX系统的应用 200

第十一章重组DNA克隆系的分析 202

质粒DNA及λ噬菌体DNA的快速分离 202

质粒DNA的少量快速分离 202

λ噬菌体DNA的少量快速分离 204

限制性核酸内切酶切点图谱的制作 205

顺序式酶切 206

用单酶切或多酶切作图 206

部分酶切 207

索氏吸印（Southern）转移 209

DNA从琼脂糖凝胶向硝酸纤维素滤膜的转移 209

索氏滤膜的杂交 211

小片段DNA在质粒载体中的次级克隆 212

具粘性末端的DNA片段的次级克隆 213

在次级克隆中使用合成的DNA接头 213

通过平头末端DNA片段连接产生限制酶切点 216

克隆步骤的快速连续法 217

启动子 219

第十二章大肠杆菌中表达克隆化DNA的载体 219

使用λ噬菌体PL启动子的载体 220

其他启动子 222

核糖体结合位点 222

真核基因的表达 223

表达非融合性真核蛋白的载体 223

表达融合性真核蛋白的载体 229

克隆化基因的高效表达 235

增加基因的剂量 235

小结 235

玻璃和塑料器皿 237

有机试剂的制备 237

附录A生物化学技术 237

液体培养基 238

用于λ噬菌体操作的溶液 239

抗生素 239

缓冲液和溶液的配制 240

蛋白水解酶 242

酶 243

限制性核酸内切酶酶切缓冲液 244

常用的电泳缓冲液 244

常用凝胶上样缓冲液 244

32P标记核苷酸乙醇水混合液的干燥浓缩 245

核酸的纯化 245

透析袋的预处理 245

核酸的浓缩 246

Sephadex G-50层析 248

DNA和RNA的定量 249

放射自显影 250

核酸放射活性的测定 252

作分子量标记的多体质粒的制备 252

Mavam-Gilbert序列测定技术 253

附录B pBR322 256

pBR322的核苷酸序列 256

pBR322的限制酶切点 260

pBR322DNA的限制性片段 265

附录C常用细菌菌株 274

参考文献 276