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第一章 总论 1

第一节 细胞生物学的发展和细胞工程的兴起 1

第二节 动物细胞工程的发展和内容 2

一、动物细胞培养 2

二、细胞融合和单克隆抗体技术 2

三、细胞拆合、核移植和动物克隆 3

四、基因转移和转基因动物 4

五、干细胞工程和再生医学 6

第三节 动物细胞工程的应用 7

一、细胞融合和单克隆抗体的应用 7

二、转基因技术的应用 8

三、细胞治疗 9

参考文献 10

第二章 动物细胞培养 11

第一节 引言 11

一、细胞培养发展简史 11

二、细胞系、细胞株和克隆 12

三、二倍体和细胞的转化 13

第二节 细胞培养及其应用 13

一、培养细胞的种类 13

二、培养细胞的特征 14

三、人体细胞体外培养的一些新进展 14

四、细胞培养技术的一些新应用 16

第三节 细胞培养的基本技术 17

一、设备、试剂及培养基的选择和配制 17

二、细胞培养技术 20

三、细胞培养物在液氮中的保存和复苏 23

第四节 培养细胞的鉴定 24

一、细胞种属鉴定的方法 24

二、杂交瘤细胞的特殊鉴定 30

第五节 细胞培养实验室 31

一、实验室设计、装置和技术 32

二、生物安全防护级别 33

第六节 细胞污染的检验 34

一、细菌和真菌污染 35

二、支原体污染 37

三、病毒污染 40

四、原生动物污染 45

第七节 其他同体外动物细胞有关的问题 48

一、培养细胞的起源和特征 48

二、各种细胞的特征性标志 49

三、细胞特异性抗原 49

附：人恶性肿瘤连续性细胞系（株）建系（株）标准的建议 50

五、细菌内毒素问题 50

四、具有特定性功能的细胞 50

参考文献 53

第三章 细胞融合 55

第一节 细胞融合的基本技术 55

一、细胞融合的机理 55

二、诱发细胞融合的融合剂和细胞融合方法 56

第二节 融合细胞的筛选 58

三、由温度敏感突变型细胞组成的杂种细胞的筛选 59

二、基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选 59

一、基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选 59

四、具有所需性状杂种细胞的筛选 60

第三节 融合细胞克隆化 60

一、有限稀释法 60

二、半固体培养基法 60

三、显微操作法 60

四、荧光激活分选法 60

二、基因定位 61

一、淋巴细胞杂交瘤 61

第四节 细胞融合的应用 61

三、遗传基因的缺陷互补 62

四、分化功能的表达调控研究 63

五、体细胞杂种的致瘤性分析 63

六、制作疫苗 64

七、核移植和克隆动物 64

参考文献 65

二、融合亲本的选择 66

一、基本原理 66

第四章 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 66

第一节 B淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 66

三、细胞融合的方法 67

四、杂交细胞的选择 67

第二节 单克隆抗体的特性和应用 68

一、单克隆抗体的特性——亲和力和特异性 68

二、B淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的应用 69

一、人杂交瘤单克隆抗体 71

二、基因工程抗体 71

第三节 人杂交瘤单克隆抗体和基因工程抗体 71

第四节 T淋巴细胞杂交瘤 74

一、建立T细胞杂交瘤的方法 74

二、T淋巴细胞杂交瘤的类型及其应用 75

三、T细胞杂交瘤的问题 75

参考文献 76

第五章 外源基因在真核细胞中的表达 77

第一节 外源基因在毕赤酵母中的表达 77

三、表达菌株的筛选 79

一、毕赤酵母菌质粒电转化方法 79

二、高拷贝插入的转化菌株筛选 79

第二节 杆状病毒和昆虫细胞表达系统 80

第三节 哺乳动物细胞表达系统 81

一、影响外源基因在哺乳动物细胞中转录和翻译的序列因素 81

二、哺乳动物细胞的表达载体 82

三、筛选标志基因 83

四、外源基因在哺乳动物细胞中的表达方式 83

五、外源DNA导入哺乳动物细胞的方法 84

第四节 基因表达产物的检测 88

参考文献 89

第六章 基因打靶 90

第一节 胚胎干细胞的获得和培养 90

一、基因打靶用ES细胞的建株 91

二、ES细胞的核型分析 93

三、ES细胞的扩增 94

第二节 打靶载体的构建 96

第三节 重组ES细胞的筛选 97

一、饲养层细胞的准备 97

二、ES细胞的准备 98

三、转染ES细胞 98

四、挑取ES克隆 99

五、96孔板ES细胞备份与细胞冻存 100

六、Southern杂交 100

第四节 嵌合体小鼠的制备 101

一、ES细胞的复苏 101

二、ES细胞的囊胚注射 101

第五节 基因敲除小鼠的建立 102

第六节 Cre-loxP系统、FLP/FRT系统和条件性基因敲除 103

第七节 基因敲入 106

第八节 大规模ES细胞突变库的建立 107

参考文献 108

第一节 染色体介导的基因转移 109

第七章 染色体工程 109

一、染色体的分离技术 110

二、染色体转移技术 110

三、被转移的染色体片段的大小 112

第二节 染色质介导的基因转移 112

一、染色质作为转基因载体的提出 112

二、（全）染色质的分离 114

三、活性染色质的制备 114

四、活性染色质作为基因载体的特点与鉴定 115

第三节 酵母人工染色体 116

一、完整的染色体DNA的提取 117

二、基因组DNA酶切大片段的获取 117

三、YAC载体臂的制备 118

四、YAC臂与目的DNA大片段的连接 119

五、YAC重组体对酵母的转化 119

六、YAC基因库的保存 120

七、YAC基因库的鉴定 120

八、目的基因YAC克隆的筛选 121

第四节 细菌人工染色体 122

九、目的基因YAC克隆的鉴定 122

一、BAC载体的结构 123

二、BAC基因组文库的构建 124

第五节 哺乳类人工染色体 125

参考文献 127

第八章 胚胎性干细胞 129

第一节 概述 129

一、胚胎性干细胞和发育 129

二、干细胞分类 130

第二节 ES细胞和EG细胞培养建系技术 131

一、饲养层细胞培养法 132

二、无饲养层培养法 132

三、胚胎细胞来源 132

四、ES细胞和EG细胞的培养过程 133

五、ES细胞和EG细胞系的特性和鉴定 135

一、基本原理 138

第三节 ES细胞和EG细胞体外诱导分化 138

二、ES细胞和EG细胞定向诱导分化 139

三、ES细胞体外诱导分化的基本方法 139

四、ES细胞体外诱导分化的几种细胞 140

第四节 诱导分化细胞的永生化 142

第五节 ES细胞和EG细胞技术学在医学中的应用 143

一、哺乳类发育的体外模型 143

二、介导改造动物的基因 144

三、人体的基因和细胞治疗 145

四、组织工程的种子细胞来源 147

参考文献 149

第九章 成体干细胞 151

第一节 概论 151

第二节 成体干细胞分化的可塑性 152

一、骨髓干细胞 152

二、神经干细胞 153

三、肝干细胞 154

四、骨骼肌干细胞 155

一、骨髓间质干细胞 156

第三节 成体干细胞的体外培养和特性 156

二、造血干细胞 157

三、神经干细胞 158

第四节 成体干细胞研究中的问题 159

一、异质性 159

二、干细胞所处环境 160

三、可塑性的调控 160

第五节 成体干细胞在再生医学中的应用 161

五、体外增殖 161

四、分化细胞的功能 161

一、组织工程化皮肤 162

二、组织工程化骨骼 162

三、骨髓与组织工程 162

参考文献 163

第十章 转基因动物 165

第一节 转基因动物实验的常用方法 166

一、DNA显微注射法 167

二、胚胎干细胞转导 168

三、精子转导 170

四、反转录病毒转导 171

五、细胞核移植 172

第二节 转基因动物技术 173

一、显微注射用DNA的制备 173

二、受精卵的超排和获取 175

三、受精卵的显微注射和移植 177

一、转基因小鼠分析用组织DNA的制备 178

第三节 转基因小鼠的鉴定 178

二、PCR鉴定转基因小鼠 179

三、Southern印迹杂交分析法鉴定转基因小鼠 180

第四节 纯合子转基因小鼠的建立 180

一、纯合子转基因小鼠的培育 180

二、纯合子转基因小鼠的鉴定 181

参考文献 182

第十一章 胚胎工程 183

第一节 胚胎移植技术 183

一、同期发情和超数排卵 183

二、胚胎采集 184

三、胚胎的检查及鉴定 185

四、胚胎的移植 185

五、影响胚胎移植妊娠率的因素 186

第二节 胚胎冷冻保存技术 186

一、胚胎冷冻的原理 186

二、胚胎的冷冻方法 187

三、冷冻效果的鉴定 187

第三节 胚胎分割技术 188

四、存在问题 188

一、胚胎分割的理论依据 189

二、分割方法 189

三、胚胎分割时需要注意的问题 189

第四节 体外受精技术 190

一、卵母细胞的获取 191

二、卵母细胞的成熟培养 191

三、精子的获能 191

第五节 胚胎工程研究中的胚胎干细胞技术 192

六、存在问题 192

五、受精卵的体外培养 192

四、体外受精 192

一、分离培养胚胎干细胞的意义 193

二、哺乳动物ES细胞的生物学特性 193

三、ES细胞的建系方法 194

四、ES细胞的鉴定 195

第六节 动物克隆技术 196

一、动物克隆技术的意义 196

二、研究概况 196

三、动物克隆技术路线 198

四、主要技术操作 198

五、存在的问题 200

参考文献 200

第十二章 鱼类细胞工程 201

第一节 鱼类细胞培养 201

一、鱼类细胞培养的发展与现状 201

二、鱼类组织（细胞）培养技术 201

三、鱼类细胞培养的应用 203

第二节 鱼类细胞核移植 205

一、细胞核移植的涵义 205

二、细胞核移植研究的发展历史和细胞全能性 205

三、鱼类细胞核移植技术 207

四、细胞核移植技术在鱼类育种中的应用 208

第三节 鱼类染色体组操作 209

一、染色体组工程 209

二、鱼类染色体组研究的历史和发展 210

三、人工诱导鱼类多倍体的方法 212

四、多倍体倍性鉴定的方法 214

五、鱼类多倍体的应用及发展趋势 215

第四节 鱼类基因转移 218

一、转基因鱼的产生及其意义 218

二、鱼类基因转移研究方法 218

三、转移目的基因 220

四、转基因鱼模型 221

五、鱼类基因转移研究尚待解决的问题 223

六、转植基因鱼研究的前景及展望 224

参考文献 225

第十三章 人造细胞 229

一、人造细胞的基本结构 229

二、人造细胞的膜结构 230

三、人造细胞和环境之间的物质转运 230

四、人造细胞的能量支持 231

五、人造细胞内的大分子代谢活动 231

六、核酶和人造细胞的增殖 232

参考文献 233

七、人造细胞在生物技术中的应用 233

第十四章 发展和展望 234

一、生物制药 234

二、组织工程和再生医学 236

三、生殖克隆和治疗克隆 238

四、干细胞研究的发展 239

参考文献 241

中西文名词对照 242