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第一章基础篇 1

第一节分子生物学实验室常用基本器具 1

一、常用基本器具 1

二、常用器具的材料 6

第二节通用实验设备及其使用方法 9

一、天平 9

二、pH计 11

三、分光光度计 11

四、微量移液器 12

五、离心机 15

六、恒温箱 17

七、振摇器 19

八、超净工作台 20

第三节实验室基础准备工作 21

一、实验用水的制备 21

二、消毒灭菌 23

三、液氮的使用 26

四、实验器具的硅化 27

五、实验用醇及酚类的准备 28

一、分子生物学实验室常用试剂浓度表示法 31

第四节实验用试剂 31

二、试剂的保存 32

三、实验室中试剂的管理 32

第五节安全防护 32

一、放射性核素的防护 32

二、危险化学试剂及防护 33

三、生物安全防护 34

第二章核酸的基础理论 36

第一节核酸 36

一、核酸的组成与结构 36

二、核酸的理化特性 42

三、核酸的光谱学 44

四、核酸的降解与合成 45

第二节基因与染色体 47

一、基因 47

二、染色体 53

第三节细胞分裂周期 59

一、有丝分裂 59

二、减数分裂 62

一、复制 66

第四节遗传信息的传递 66

二、转录 70

三、翻译 75

第三章核酸的制备 80

第一节真核细胞DNA的制备 80

一、概论 80

二、从培养的动物细胞或组织中提取高分子质量DNA 84

三、血液样品中DNA的制备 87

四、残存蛋白质和RNA的检测 88

一、试剂 89

第二节细菌细胞DNA的提取 89

五、真核细胞基因组DNA制备中的注意事项 89

二、实验流程 90

三、制备大分子质量细菌DNA的几个关键步骤 91

第三节质粒DNA的分离纯化 91

一、概论 91

二、氯化铯密度梯度离心法 93

三、碱裂解法 94

四、煮沸法 97

五、试剂盒提取及纯化质粒 97

第四节RNA的制备 98

一、RNA的结构和分布 99

二、RNA制备中的关键因素 101

三、组织细胞总RNA分离制备 103

第四章电泳技术 107

第一节电泳技术的基本原理 107

第二节影响泳动率的因素 108

一、样品 108

二、支持介质 108

四、缓冲液的离子强度 110

三、电场强度 110

第三节凝胶电泳的基本技术和条件 111

一、核酸凝胶电泳的分类 111

二、缓冲液系统 112

三、样品的配制 112

四、电泳条件的考虑 113

五、染色 113

六、电泳结果的记录 115

第四节琼脂糖凝胶电泳 116

一、仪器设备及材料 117

二、电泳操作步骤 118

第五节碱性琼脂糖凝胶电泳 120

第六节聚丙烯酰胺凝胶电泳 122

一、仪器设备及试剂 123

二、制胶准备 124

三、制胶 125

四、电泳 126

五、染色及结果观察 126

第七节双向电泳 127

一、等电聚焦电泳 128

二、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 138

三、双向电泳结果的分析鉴定 144

第八节凝胶扫描、成像系统 148

第五章工具酶 151

第一节限制性内切酶 151

一、概述 151

二、常用的三种内切酶 153

三、其他类型内切酶 157

四、甲基化酶 158

五、与内切酶相关的几个概念 160

六、限制性内切酶酶切反应 161

七、DNA分子的限制性内切酶酶谱 163

一、DNA聚合酶 165

第二节DNA重组常用的其他酶类 165

二、RNA聚合酶 167

三、DNA连接酶 168

四、反转录酶 168

七、核糖核酸酶H 169

八、核糖核酸酶U2、核糖核酸酶CL3 169

九、脱氧核糖核酸酶I 169

六、核糖核酸酶T1 169

五、核糖核酸酶A 169

十、核酸酶S1 170

十一、核酸酶Bal31 170

十二、核酸外切酶 170

十三、末端转移酶 170

十四、多核苷酸激酶 171

十五、碱性磷酸酯酶 171

第六章基因克隆技术 172

第一节目的基因DNA的制备 172

一、从染色体中获得 172

三、聚合酶链式反应扩增特定的基因片段 174

二、人工合成 174

第二节基因克隆载体 175

一、质粒 176

二、噬菌体 185

三、真核细胞为宿主的克隆载体 194

四、反转录病毒载体 202

第三节DNA分子的体外重组 204

一、DNA连接酶 204

二、外源性基因DNA片段与载体DNA的连接 207

三、影响DNA连接的因素 212

第四节重组DNA导入宿主细胞 213

四、DNA在凝胶内的连接 213

一、转化的方法 214

二、氯化钙法转化大肠杆菌（全部过程需无菌操作） 215

三、重组DNA克隆的筛选与鉴定 218

第五节基因组文库的构建 222

一、构建基因文库的准备条件 223

二、基因文库的构建 226

第六节cDNA文库的构建 235

一、总RNA的提取及mRNA的制备 236

二、cDNA文库的构建 238

第七章聚合酶链式反应 244

第一节PCR基本原理 244

一、基本原理 244

二、“长产物片段”与“短产物片段” 246

三、平台效应 248

第二节PCR反应条件的优化 249

一、标准PCR反应流程 249

二、PCR反应条件的优化 249

一、设计原则 254

第三节引物的设计 254

二、引物长度 255

三、引物的5＇端修饰法 256

四、简并引物 257

五、嵌套引物 258

第四节PCR反应模板的制备 259

第五节耐热DNA聚合酶 260

一、TaqDNA聚合酶 260

二、其他耐热DNA聚合酶 263

二、热启动PCR的几种技术 265

一、热启动PCR的原理 265

第六节热启动PCR 265

第七节降落PCR 268

第八节PCR相关技术的发展 269

一、不对称PCR 269

二、多重PCR 271

三、着色互补PCR 272

四、巢式PCR 272

五、锚定PCR 273

六、反向PCR 273

八、增敏PCR 275

七、锅柄PCR 275

九、重组PCR 276

十、表达PCR 277

十一、原位PCR 278

十二、RNA的聚合酶链反应 279

十三、cDNA末端快速扩增 280

十四、差异显示PCR 286

十五、定量PCR 286

第九节PCR产物的检测 295

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 296

一、琼脂糖凝胶电泳 296

四、分子杂交 297

五、微孔板夹心杂交法 297

三、层析技术 297

六、限制性内切酶酶切分析 298

七、酶免疫法检测PCR 298

八、PCR扩增产物的直接测序 299

第十节PCR的污染及对策 299

一、PCR污染 299

三、对照实验 300

二、污染的预防 300

四、污染源的处理 301

第十一节PCR技术的应用 302

一、基因分析 302

二、定序克隆 308

三、序列分析 309

第八章核酸分子探针的标记 311

第一节概述 311

一、探针的种类及其选择 311

二、各种标记物及其选择 312

三、各种标记方法及其选择 317

第二节非放射性DIG标记方法 317

一、非放射性DIG标记方法的比较 317

二、PCR标记法 319

三、随机引物标记法 322

四、体外转录标记RNA探针 325

五、三种标记方法重要参数的比较简表 329

第三节探针标记效率的评估 330

一、直接检测过程 330

二、琼脂糖凝胶电泳分析PCR标记探针 331

第九章核酸分子杂交 332

第一节Southern杂交 332

一、琼脂糖凝胶分离DNA样品 332

二、DNA的转膜（Southern印迹，虹吸印迹法） 333

三、预杂交 336

四、DIG标记的DNA探针与靶DNA的杂交 337

第二节RNA探针的Northern杂交 342

一、琼脂糖凝胶分离RNA样品 342

二、RNA的转膜（Northern印迹，虹吸印迹法） 343

三、预杂交 344

四、DIG标记的RNA探针与RNA的杂交 345

五、做核酸杂交时，如何取得良好结果 345

第三节非放射性核素探针的检测 347

一、光学检测 347

二、化学发光检测 349

第四节使用DIG标记的探针进行菌落和噬菌斑的杂交 351

一、菌落／噬菌斑滤膜的准备步骤 351

二、DIG标记的DNA探针与菌落／噬菌斑滤膜的杂交 353

三、化学发光法检测探针－靶基因杂交信号 353

四、显色法检测探针－靶基因杂交信号 354

五、菌落／噬菌斑杂交的影响因素 355

第五节核酸原位杂交 355

一、核酸原位杂交的基本要点 355

二、结果的评定 358

附：Western印迹检测表达蛋白质 359

一、哺乳细胞的裂解 359

二、蛋白质的电转移 359

三、封闭 360

四、靶蛋白与第一抗体反应 360

六、显色 361

五、与第二抗体反应 361

第十章测序 362

第一节概论 362

第二节Sanger双脱氧法 363

一、基本原理 363

二、经典测序反应——M13单链测序系统 366

三、双链DNA测序反应系统 375

四、循环测序法 378

五、PCR产物直接测序 380

一、化学法基本原理 383

第三节Maxmam-Gilbert化学法 383

二、化学法测序的一般流程 385

三、化学法的优缺点 387

第四节杂交测序 388

第五节自动化测序 392

一、自动化测序仪 392

二、全自动化测序流程 399

第六节DNA大片段序列测定的战略 405

一、随机测序 405

二、定向测序法 409

三、全基因组测序策略 411

第七节DNA测序技术新进展 414

第十一章新技术 419

第一节mRNA差异显示技术 419

一、概述 419

二、基本原理 423

三、实验设计和优化 424

四、实验操作 431

五、差异显示技术衍生的方法 440

六、差异显示技术的应用 441

七、存在的问题和解决的策略 450

八、展望 451

第二节生物芯片 452

一、生物芯片技术的基本原理 453

二、生物芯片技术的特点 453

三、生物芯片的应用 454

四、生物芯片技术存在的问题及发展前景 457

第三节激光捕获纤维切割技术 459

一、LCM技术的主要原理及简单操作 459

二、LCM技术的特点、存在问题及相应对策 460

三、LCM技术在生命科学研究中的应用状况 461

四、LCM技术的发展前景 462

第十二章生物信息学及其在分子生物技术中的应用 465

第一节概述 465

一、生物信息学的概念 465

二、生物信息学的发展 466

三、生物信息学的研究现状 469

第二节生物信息学的研究方法和内容 471

一、研究方法 471

二、研究内容 489

一、生物信息数据库及其分类 494

第三节生物信息数据库 494

二、生物信息数据库介绍 495

三、数据库的查询 497

四、全球生物信息数据库 499

第四节序列比对和数据库搜索 511

一、序列比对 511

二、数据库搜索 513

第五节生物信息学的应用 516

一、序列分析 516

二、核酸序列装配和拼接 524

三、电子基因定位 525

四、基因表达的电子组织分布 528

五、功能预测 529

六、蛋白质结构预测 531

七、向数据库提交序列 532

八、SNP分析 533

第六节研究实例 534

一、实例一 534

二、实例二 539

三、其他研究路线 540

二、常用的缓冲液和试剂 543

附录 543

一、遗传密码子表 543

三、铬酸洗液及配制方法 551

四、放射性核素资料 552

五、核酸及蛋白质数据 553

六、常用分子质量标准参照物 554

七、细胞培养中出现的常见问题、原因及解决方法 556

八、分子生物学研究中的网上资源 557

缩略语 559

索引 564