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第1章 绪论 1

1.1 基因工程的基本定义 1

1.2 基因工程的诞生 1

1.3 基因工程的发展历程 3

1.4 基因工程的技术路线 4

1.5 基因工程的研究内容 5

1.5.1 克隆工具 5

1.5.2 基因克隆技术 6

1.5.3 目的基因 6

1.5.4 基因工程的应用研究 6

1.5.5 基因工程的安全性研究 6

1.6 学习和研究基因工程的意义 7

复习题 8

第2章 基因工程的工具酶 9

2.1 限制性核酸内切酶 9

2.1.1 限制性内切酶的发现与分类 9

2.1.2 限制性核酸内切酶的命名 11

2.1.3 Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 11

2.1.4 影响限制性核酸内切酶酶解反应的因素 13

2.1.5 限制性核酸内切酶的应用 14

2.2 DNA连接酶 14

2.2.1 DNA连接酶的种类 14

2.2.2 DNA连接酶的机理 15

2.2.3 影响DNA连接酶的反应条件 15

2.3 DNA聚合酶 15

2.3.1 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 16

2.3.2 Klenow片段 16

2.3.3 T4噬菌体DNA聚合酶 17

2.3.4 T7噬菌体DNA聚合酶 17

2.3.5 测序酶 17

2.3.6 Taq DNA聚合酶 17

2.3.7 反转录酶 18

2.4 其他工具酶 18

2.4.1 末端脱氧核苷酸转移酶 18

2.4.2 T4多核苷酸激酶 18

2.4.3 碱性磷酸酶 19

2.4.4 单链核酸内切酶 19

2.4.5 核酸外切酶 19

2.4.6 甲基化酶 20

复习题 20

第3章 基因工程载体 21

3.1 质粒 22

3.1.1 质粒的基本生物学特性 22

3.1.2 构建质粒克隆载体的策略 23

3.1.3 质粒载体的构建 24

3.1.4 质粒的种类和用途 25

3.1.5 经典的大肠杆菌质粒载体 26

3.1.6 质粒载体的稳定性问题 29

3.2 噬菌体载体 30

3.2.1 λ噬菌体载体 30

3.2.2 M13噬菌体载体 32

3.3 噬菌体-质粒杂合载体 33

3.3.1 柯斯质粒载体 33

3.3.2 噬菌粒载体 35

3.4 人工染色体载体 35

3.4.1 酵母人工染色体载体 36

3.4.2 细菌人工染色体载体 37

3.4.3 P1人工染色体载体 37

3.4.4 哺乳动物人工染色体 38

3.4.5 人类人工染色体 38

3.4.6 植物人工染色体 38

复习题 39

第4章 受体细胞 40

4.1 原核受体细胞 40

4.1.1 大肠杆菌 41

4.1.2 枯草芽孢杆菌 41

4.1.3 蓝细菌 41

4.2 真菌受体细胞 42

4.2.1 酵母菌 42

4.2.2 丝状真菌 42

4.3 真核受体细胞 43

4.3.1 植物细胞 43

4.3.2 动物细胞 45

复习题 45

第5章 目的基因的制备 46

5.1 直接分离法 47

5.1.1 限制性内切酶酶切分离法 47

5.1.2 利用酶促反转录法直接从特定mRNA分离基因 47

5.1.3 机械方法 47

5.1.4 物理化学法 47

5.2 化学合成法 48

5.2.1 化学合成法的原理 48

5.2.2 化学合成法的步骤 49

5.2.3 化学合成法的应用 49

5.3 PCR扩增目的基因 49

5.3.1 PCR反应特点 50

5.3.2 PCR克隆目的基因 51

5.3.3 PCR技术改造已知基因 54

5.4 构建基因文库分离目的基因 55

5.4.1 基因文库的构建 56

5.4.2 基因文库构建的注意事项 56

5.4.3 基因组文库与cDNA文库的区别 58

5.4.4 克隆的鉴定方法 59

5.5 根据基因的差异表达分离目的基因 60

5.5.1 mRNA差别显示技术 60

5.5.2 抑制性消减杂交 60

5.5.3 酵母双杂交技术分离目的基因 63

复习题 64

第6章 DNA重组的操作 65

6.1 重组子的构建 65

6.1.1 相同黏性末端连接 65

6.1.2 不同黏性末端的连接 66

6.1.3 平末端连接 67

6.1.4 修饰黏性末端连接 67

6.1.5 PCR产物的连接 68

6.1.6 影响外源DNA片段与载体DNA连接反应的因素 70

6.2 重组DNA分子的转化和扩增 71

6.2.1 Ca2+诱导转化 71

6.2.2 电穿孔转化方法 72

6.2.3 接合转化法 72

6.2.4 λ噬菌体转导法 73

6.2.5 转染 73

6.2.6 转化率及其影响因素 73

6.3 重组子的筛选与鉴定 75

6.3.1 表型筛选法 75

6.3.2 结构分析法 78

6.3.3 限制酶谱分析筛选 78

6.3.4 PCR扩增鉴定筛选 79

6.3.5 目的克隆的鉴定 80

复习题 86

第7章 克隆基因在受体细胞中的表达调控 87

7.1 克隆基因在原核细胞中的表达调控 87

7.1.1 原核生物基因表达调控的特点 88

7.1.2 原核生物基因表达的表达系统 88

7.1.3 克隆基因在大肠杆菌中的表达调控 89

7.2 外源基因在真核细胞中的表达 98

7.2.1 真核生物基因表达与调控的特点 98

7.2.2 真核细胞表达系统 99

复习题 109

第8章 转基因生物 110

8.1 转基因植物 110

8.1.1 转基因植物的技术路线 110

8.1.2 目的基因的选择与克隆 111

8.1.3 植物基因转化方法 111

8.1.4 转基因植物的筛选和鉴定 118

8.1.5 转基因植物中外源基因的沉默 119

8.1.6 提高目的基因在转基因植物中的高效表达策略 120

8.1.7 转基因植物的应用 122

8.2 转基因动物 123

8.2.1 转基因动物的基本操作过程 123

8.2.2 转基因动物的制备技术 124

8.2.3 外源基因导入动物细胞的方法 124

8.2.4 转基因动物的鉴定 132

8.2.5 转基因动物研究中出现的问题 133

8.2.6 提高外源基因在动物中的表达效率的策略 134

8.2.7 转基因动物的应用 135

8.3 转基因微生物 137

8.3.1 微生物基因工程的技术流程 137

8.3.2 微生物基因工程的应用 137

复习题 138

第9章 基因工程的安全性 139

9.1 转基因生物的安全性 139

9.1.1 生物安全的含义与基本内容 139

9.1.2 转基因生物的环境安全性 140

9.1.3 转基因生物的健康性 140

9.1.4 与基因工程产品安全性有关的重要事件 141

9.2 生物安全政策、法规 143

9.2.1 国际社会对基因工程的态度与规则 143

9.2.2 我国基因工程安全管理措施 144

9.3 转基因生物的安全性评价 144

9.4 转基因生物的经济、伦理问题 145

9.4.1 转基因生物与国际贸易和社会经济问题 145

9.4.2 转基因生物的社会伦理问题 146

复习题 148

附录 149

附录1 基因工程相关网站 149

附录2 科研案例分析 149

附录3 中英文名词解释 183

参考文献 193