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第一章 丝状真菌基因型特征的鉴定 1

1 概述 1

2 基因组变异的主要特征 1

3 确定研究目的 2

4 用于基因组分析的技术 3

5 假设 8

6 选择最佳策略 9

方案1 链格孢真菌的RAPD分析 11

7 AFLP技术的原理及其应用 13

方案2 丝状真菌的AFLP分析 16

方案3 丝状真菌的cDNA-AFLP 19

8 变性梯度凝胶电泳（DGGE） 21

方案4 土壤中真菌的DGGE分析 22

9 重要的数据库和互联网资源 24

第二章 丝状真菌核酸的提取与分析 26

1 概述 26

2 基因组DNA的分离 26

方案1 CTAB法提取真菌基因组DNA 27

方案2 氯化苄（benzyl chloride）法提取真菌基因组DNA 28

方案3 丝状真菌总DNA的分离 29

方案4 固体平板上菌小量DNA的块速提取（以稻瘟病菌为例） 31

方案5 真菌小量DNA的快速提取 31

3 丝状真菌RNA的提取 32

4 RNA的操作 32

方案6 Trizol法提取丝状真菌总RNA 33

方案7 丝状真菌总RNA的提取 33

方案8 真菌总RNA的小量提取（Trizol法） 34

第三章 丝状真菌的DNA转化 35

1 概述 35

2 选择性标记和转化载体 35

3 待转化DNA的质量 37

4 DNA的进入 37

5 REMI转化 38

方案1 稻瘟病菌（Magna porthe grisea）原生质体的制备及转化 38

方案2 毛壳菌原生质体的制备 39

6 真菌ATMT转化 40

方案3 感受态农杆菌细胞的制备与转化 40

方案4 利用农杆菌转化真菌 41

7 电击转化 42

方案5 Tapesia yallundae的电击转化 42

8 转化DNA的命运 42

方案6 丝状真菌中的质粒拯救 43

方案7 农杆菌电击转化感受态的制备与转化 45

第四章 丝状真菌的遗传分析 48

1 子囊菌遗传分析 48

方案1 对真菌孢子进行化学诱变 49

方案2 对真菌的孢子进行紫外诱变 50

方案3 营养缺陷型突变体的筛选与鉴定 51

方案4 温度敏感型突变群体的制备 51

方案5 单孢分离 52

方案6 构巢曲霉的八分体分析 53

方案7 通过准性重配确定里连锁群 54

方案8 稻瘟病菌温度敏感型突变体的筛选 55

2 担子菌遗传分析 56

方案9 鬼伞菌在人工培养条件子实体和担孢子的产生 58

方案10 通过CHEF凝胶电泳分离C.cinereus的染色体 62

方案11 C.cinereus的四分体分离 64

方案12 C.cinereus粉孢子的紫外诱变 65

方案13 利用NTG（MNNG）/EMS对担子菌进行诱变 66

方案14 平板印迹 68

附：担子菌研究中的标准培养基 69

第五章 丝状真菌的基因组分析 70

1 概述 70

2 遗传图谱 70

方案1 克隆固定大小的基因组DNA作为RFLP探针 71

方案2 RAPD操作要点 71

3 电泳核型分析 73

方案3 琼脂糖栓中制备完整染色体DNA 73

方案4 琼脂糖栓电泳 73

方案5 钳位均匀电场电泳 74

4 物理图谱 75

方案6 染色体DNA的RecA-AC 75

方案7 准备BAC载体DNA 78

方案8 准备BAC插入DNA 78

方案9 BAC插入DNA大小的选择，恢复和克隆 79

方案10 将文库克隆排列到杂交膜上 80

方案11 收集克隆文库 80

5 筛选文库 81

方案12 Southern杂交分析混合文库和克隆阵列文库 81

6 染色体步移（chromosome walking） 82

方案13 BAC或者黏粒末端RNA探针的合成 82

方案14 根据插入片段末端序列制备的探针 83

7 真菌基因组分析相关数字资源 85

第六章 真菌发育过程的细胞学分析 86

1 概述 86

2 丝状真菌生长的测定 86

方案1 菌丝顶端生长的测定 86

方案2 菌落生长速度的测定 87

方案3 直线生长速率的测定 87

3 丝状真菌孢子的萌发 87

方案4 真菌孢子的萌发测定 87

4 稻瘟病菌细胞生物学分析 87

方案5 稻瘟病菌产孢培养、孢子收集和附着胞诱导培养 88

方案6 稻瘟病菌侵染过程的组织病理学观察 88

方案7 稻瘟病菌孢子、附着胞内脂质体、糖原的观察 88

方案8 细胞自噬现象的观察 89

方案9 酒精氧化酶活性测定 89

方案10 冷冻替代用于电子显微镜观察 90

方案11 细胞核，细胞壁和隔膜的染色 90

第七章 丝状真菌的信号传导 92

1 概述 92

2 蛋白抽提 93

方案1 构巢曲霉（Aspergillus nidulans）蛋白激酶的抽提 93

3 蛋白免疫沉淀反应 94

方案2 NIMA在大肠埃希菌（E.coli）中的表达和His-tag亲和纯化 94

方案3 蛋白质免疫沉淀（IP） 95

4 凝胶阻滞试验（gel-shift assay）检测蛋白的磷酸化状态 95

方案4 NIMA磷酸化状态的凝胶阻滞试验 96

5 蛋白激酶的底物特异性分析 96

方案5 NIMA激酶分析 97

第八章 丝状真菌的细胞生物学技术 98

1 电子显微镜工作原理及其应用 98

2 扫描电子显微镜样品制备的原理与方法 99

3 透射电子显微镜样品制备的原理与方法 101

4 电镜细胞化学技术 104

5 免疫组化技术 117

第九章 丝状真菌的生化研究方法 120

1 概述 120

2 抽提物的准备 120

方案1 菌丝的摇瓶培养 120

方案2 疏水蛋白的分离 120

3 细胞组分的准备 121

方案3 细胞膜的分离 121

方案4 脉孢霉的液泡分离 122

方案5 线粒体的分离 123

方案6 细胞核的分离 123

方案7 细胞核的抽提 124

方案8 微体的分离 125

4 蛋白分析 125

方案9 孢子和菌丝的小量的蛋白质抽提 125

方案10 从固体培养物中分离胞外酶（N.crassa的脂肪酶） 126

方案11 从新鲜菌丝分离细胞内蛋白，适用于蛋白水解敏感蛋白的方法 126

方案12 从新鲜菌丝分离细胞内蛋白 127

方案13 从冻干菌丝分离胞内蛋白 128

方案14 酶学分析的代谢物抽提 128

第十章 真菌研究中的免疫学方法 129

1 概述 129

2 免疫原分子的特性 129

方案1 免疫抗原的准备 131

3 制备多克隆抗血清 132

方案2 用辛酸和硫酸铵沉淀法纯化抗体 133

方案3 用ELISA测定pAb的滴度和检验上清液中的mAb 134

4 制备单克隆抗体 135

方案4 通过B细胞-骨髓瘤细胞融合制取鼠科杂种瘤细胞 136

方案5 荧光免疫检测 138

方案6 限制性稀释法亚克隆 139

方案7 冷冻法长期储存的杂交瘤细胞 140

方案8 应用抗原介导ELISA鉴定Ig类别／亚类 141

5 蛋白质和糖类抗原决定簇的特性 142

方案9 通过化学和酶学修饰确定的抗原决定簇的特性 143

6 其他经常使用的免疫学分析方法 144

方案10 间接DAS-ELISA 144

7 抗体的提供及其商业发展 145

第十一章 丝状真菌的功能基因组分析 146

1 构建稻瘟病菌突变子库 146

2 目标突变技术 146

3 cDNA文库构建及测序分析 147

方案1 构建附着胞cDNA文库的cDNA的合成 147

4 cDNA文库构建及筛选 152

方案2 cDNA文库构建 152

方案3 质粒pTriplEx2的插入片段的验证 155

5 抑制差减杂交技术 156

方案4 稻瘟病菌附着胞SSH差减文库的构建 158

6 丝状真菌细胞自噬及其研究方法 165

方案5 稻瘟病菌中细胞自噬研究方法 171

方案6 稻瘟病菌细胞自噬研究中的其他相关显微观察 172

方案7 双分子荧光互补技术 174

方案8 蛋白质电泳（Tricine-SDS-PAGE）及蛋白质印迹杂交 176

方案9 酵母双杂交系统研究蛋白互作 180

方案10 细胞表达目的蛋白 184

7 真菌中结合PCR（Double-Joint PCR）基因融合片段操作 186

8 真菌RNAi技术的应用 190

第十二章 丝状真菌分子进化与系统发育分析 205

1 概述 205

2 系统发育分析方法 206

方案1 木霉菌的ITS rDNA的PCR扩增 206

方案2 木霉菌的tef 1-α基因的PCR扩增 207

方案3 木霉菌进行RAPD研究 208

方案4 AFLP技术 209

3 构建系统发育树 209

第十三章 丝状真菌群体遗传分析 211

1 纯培养条件下真菌群体遗传分析 211

方案1 Pot2-rep-PCR 211

方案2 MGR586-RFLP 212

2 免培养技术用于环境中真菌群体的遗传结构分析 212

方案3 土壤真菌DNA的直接提取 215

方案4 土壤样品中真菌总DNA的提取 215

第十四章 真菌分子生物信息学常用软件的使用 217

1 概述 217

2 文件格式 217

3 FASTA格式 219

4 Tab（或其他分隔符）分隔的行文件 219

5 BLAST 222

6 Primer Premier 5 226

7 e-PCR 231

8 Clustal 235

9 BioEdit 237

10 Staden Package 239

参考文献 249