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1　概述 1

1.1　基因工程的基本概念 1

1.1.1　基因工程的基本定义 1

1.1.2　基因工程的基本过程 1

1.1.3　基因工程的基本原理 2

1.1.4　基因工程在生物工程中的地位 2

1.2　基因工程的发展历史 5

1.2.1　基因工程的诞生 5

1.2.2　基因工程的成熟 5

1.2.3　基因工程的腾飞 6

1.3　基因工程的研究意义 6

1.3.1　第四次工业大革命 7

1.3.2　第二次农业大革命 7

1.3.3　第四次医学大革命 8

2.1 DNA重组的载体 9

2 DNA重组克隆的单元操作 9

2.1.1 质粒载体 10

2.1.2 λ双链噬菌体DNA载体 15

2.1.3 M13单链噬菌体DNA载体 21

2.1.4 噬菌体-质粒杂合载体 24

2.2 DNA的体外重组（切与接） 26

2.2.1 限制性核酸内切酶 26

2 2.2　T4 DNA连接酶 32

2.2.3 其他用于DNA重组的工具酶 33

2.2.4 DNA切接反应的影响因素 36

2.2.5 DNA分子重组的方法 39

2.3 DNA重组分子的转化与扩增（转与增） 49

2.3.1 DNA重组转化的基本概念 49

2.3.2　受体细胞的选择 50

2.3.3　转化方法 53

2.3.4　转化率及其影响因素 56

2.4　转化子的筛选与重组子的鉴定（检） 57

2.3.5　转化细胞的扩增 57

2.4.1　载体遗传标记法 58

2.4.2　菌落原位杂交法 61

2.4.3　限制性酶切图谱法 68

2.4.4　克隆基因定位法 71

2.4.5　DNA序列测定法 74

2.4.6　外源基因表达产物检测法 81

2.5　目的基因的克隆 86

2.5.1　鸟枪法 86

2.5.2 cDNA法 89

2.5.3 PCR扩增法 99

2.5.4　化学合成法 104

2.5.5　基因文库的构建 108

3.1　外源基因在大肠杆菌中的高效表达原理 113

3.1.1 启动子 113

3　大肠杆菌基因工程 113

3.1.2　终止子 118

3.1.3　SD序列 119

3.1.4　密码子 120

3.1.5　质粒拷贝数 121

3.2　大肠杆菌工程菌的构建策略 122

3.2.1 包涵体型异源蛋白的表达 123

3.2.2　分泌型异源蛋白的表达 127

3.2.3　融合型异源蛋白的表达 132

3.2.4　寡聚型异源蛋白的表达 136

3.2.5　整合型异源蛋白的表达 140

3.2.6　蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 143

3.3　重组异源蛋白的体外复性活化 145

3.3.1　包涵体的溶解与变性 145

3.3.2　异源蛋白的复性与重折叠 147

3.4.1 细菌生长的动力学原理 152

3.4　大肠杆菌工程菌培养的最优化控制 152

3.4.2　发酵过程的最优化控制 155

3.4.3　大肠杆菌工程菌的高密度发酵 157

3.5　基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 159

3.5.1 工程菌遗传不稳定性的表现与机制 159

3.5.2　改善工程菌不稳定性的对策 161

3.6　利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或多肽 163

3.6.1　重组人胰岛素 164

3.6.2　重组人生长激素 168

3.6.3　重组人干扰素 174

3.6.4　重组人白细胞介素 179

3.6.5　重组抗体及其片段 183

4　非肠道原核细菌基因工程 195

4.1　芽孢杆菌的基因工程 195

4.1.1　芽孢杆菌的克隆载体系统 195

4.1.2　芽孢杆菌的宿主转化系统 200

4.1.3　芽孢杆菌的分泌表达系统 201

4.1.4　重组芽孢杆菌在耐热性酶制剂大规模生产中的应用 202

4.1.5　重组短小芽孢杆菌在人体蛋白药物生产中的应用 206

4.1.6　重组芽孢杆菌在昆虫毒素蛋白生产中的应用 207

4.2　棒状杆菌的基因工程 211

4.2.1　棒状菌属的克隆表达系统 212

4.2.2　棒杆菌属的宿主转化系统 216

4.2.3　苏氨酸基因工程菌的构建 217

4.2.4　芳香族氨基酸工程菌的构建 221

4.2.5　赖氨酸工程菌的构建 222

4.3　链霉菌的基因工程 224

4.3.1　链霉菌的载体克隆系统 225

4.3.2　链霉菌的宿主转化系统 228

4.3.3　链霉菌的基因表达调控系统 232

4.3.4　链霉菌的蛋白分泌系统 237

4.3.5　利用DNA重组技术改良抗生素生产菌 239

4.4　梭菌属的基因工程 240

4.4.1　梭菌属的重组克隆系统 241

4.4.2　利用DNA重组技术改良有机溶剂的生产菌 242

4.4.3　纤维素降解的生物机理 244

4.4.4　利用纤维素类物质发酵乙醇 245

4.5　乳酸菌的基因工程 246

4.5.1　乳杆菌属的载体转化系统 246

4.5.2　乳杆菌属的分子遗传学特性 247

4.5.3　利用DNA重组技术改良食用乳杆菌的战略 248

4.6　假单孢菌属的基因工程 248

4.6.1　假单孢菌的宿主转化系统 249

4.6.2　生物降解基因的克隆与鉴定 251

4.6.3　生物降解途径的分子设计 252

4.7　硫杆菌属的基因工程 253

4.7.1　煤利用的优势与缺陷 254

4.7.3　硫杆菌属的转化系统 255

4.7.2　煤的生物脱硫与净化 255

4.7.4　工程菌脱硫应用的可行性 256

5　真菌基因工程 257

5.1　丝状真菌的基因工程 257

5.1.1　丝状真菌的载体克隆系统 258

5.1.2　丝状真菌的宿主转化系统 261

5.1.3　丝状真菌的表达分泌系统 262

5.1.4　重组曲霉菌在重组异源蛋白生产中的应用 265

5.1.5　β-内酰胺类抗生素生产菌的改良 267

5.2　酵母菌的基因工程 269

5.2.1 酵母菌的宿主系统 269

5.2.2　酵母菌的载体系统 273

5.2.3　酵母菌的转化系统 279

5.2.4　酵母菌的表达系统 283

5.2.5　酵母菌的蛋白修饰分泌系统 290

5.2.6　利用重组酵母生产乙肝疫苗 294

5.2.7 利用重组酵母生产人血清白蛋白 298

6　昆虫基因工程 300

6.1　果蝇的基因转化系统 300

6.1.1 果蝇转座元件的结构及特征 300

6.1.2 P元件介导的果蝇杂交不育 302

6.1.3 P元件介导的果蝇经典转化程序 303

6.2　蚊虫和农业害虫的基因改造系统 305

6.2.1 用于非果蝇类昆虫转化的载体 305

6.2.2　用于非果蝇类昆虫转化株筛选的遗传标记 311

6.2.3　农业害虫的基因工程 312

6.2.4　蚊虫的基因工程 317

6.3　家蚕的基因表达系统 320

6.3.1 家蚕的分子生物学 320

6.3.2　基于杆状病毒的家蚕基因表达系统 321

6.3.3　家蚕生物反应器的构建 325

7.1.1　动物转基因的效率 328

7　高等动物基因工程 328

7.1　动物转基因技术的基本概念 328

7.1.2　动物转基因的结构 329

7.1.3　动物转基因的表达特性 329

7.1.4　动物转基因的生物学效应 330

7.2　转基因导入动物体内的方法 331

7.2.1 转基因的动物受体细胞系统 331

7.2.2　动物细胞物理转化法 332

7.2.3　动物病毒转染法 333

7.2.4　工程胚胎干细胞法 339

7.2.5　体细胞转基因克隆法 341

7.3　利用动物转基因技术研究基因的表达与功能 342

7.3.1 利用转报告基因探测动物基因组的调控序列 342

7.3.2　利用同源基因灭活细胞内源基因 344

7.3.3　利用反义基因抑制细胞基因表达 345

7.4.2　利用哺乳动物细胞大规模培养技术生产结构复杂的人体蛋白 347

7.4　利用转基因动物或细胞生产生物大分子 347

7.4.1 动物细胞高效表达异源蛋白的基本原理 347

7.4.3　利用动物乳腺组织生产蛋白药物 350

7.5　转基因技术在动物遗传性状改良中的应用 351

7.5.1　转基因鼠 351

7.5.2　转基因兔、猪、羊 352

7.5.3　转基因牛 352

7.5.4　转基因鸡 353

7.5.5　转基因鱼 353

7.6　基因治疗 354

7.6.1　基因治疗的基本战略思想 354

7.6.2　肿瘤的基因治疗 356

7.6.3　囊性纤维变性症的基因治疗 358

7.6.5　重度联合免疫缺陷症的基因治疗 360

7.6.6　糖尿病的基因治疗战略 360

7.6.4　杜兴肌营养不良症的基因治疗 360

7.6.7　骨髓细胞的转基因研究 361

7.6.8　基因治疗的副反应及其对策 362

8　高等植物基因工程 363

8.1　高等植物的遗传学特性 363

8.2　高等植物的基因转移系统 365

8.2.1　Ti质粒介导的整合转化系统 365

8.2.2　植物病毒介导的转染系统 370

8.2.3　植物细胞的直接转化方法 374

8.2.4　植物原生质体的再生 375

8.3　高等植物的基因表达系统 377

8.3.1 外源基因的四环素诱导系统 377

8.3.2　外源基因的乙醇诱导系统 379

8.3.3　外源基因的类固醇诱导系统 379

8.3.4　外源基因的地塞米松诱导和四环素抑制系统 381

8.4.2　利用病毒载体探查植物基因重排 382

8.4　利用植物转基因技术研究基因的表达与调控 382

8.4.1 利用报告基因展示高等植物基因表达与调控的信息谱 382

8.4.3　利用转座元件克隆植物基因 383

8.4.4　利用T-DNA构建植物遗传突变株 383

8.5　利用转基因植物生产重组异源蛋白和工业原料 384

8.5.1 利用植物生物反应器生产医用蛋白 384

8.5.2　利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂 386

8.5.3　利用植物生物反应器生产工业原料 386

8.6　转基因技术在植物品种改良中的应用 387

8.6.1　控制果实成熟的转基因植物 387

8.6.2　抗虫害的转基因植物 388

8.6.3　抗病原体的转基因植物 389

8.6.4　抗除草剂的转基因植物 391

8.6.5　改变花形花色的转基因植物 391

8.6.6　抗环境压力的转基因植物 392

8.6.7　产生高品质产物的转基因植物 392

8.6.8　转基因植物的安全性 393

9　第二代基因工程——蛋白质工程 395

9.1　蛋白质工程的基本概念 395

9.1.1　蛋白质工程的基本特征 395

9.1.2　蛋白质工程的研究内容及应用 396

9.1.3　蛋白质工程实施的必要条件 397

9.2　基因的体外定向突变 398

9.2.1　局部随机掺人法 398

9.2.2　碱基定点转换法 399

9.2.3　部分片段合成法 399

9.2.4　引物定点引入法 401

9.2.5　PCR扩增突变法 402

9.3　基因的体外定向进化 404

9.3.1 易错PCR 406

9.3.2　DNA改组 406

9.3.4　交错延伸 408

9.3.3　体外随机引发重组 408

9.3.5　过渡模板随机嵌合生长 409

9.3.6　渐增切割杂合酶生成 411

9.3.7　同源序列非依赖性蛋白质重组 411

9.3.8　突变文库的筛选模型 413

9.4　蛋白质工程的设计思想与应用 414

9.4.1 提高蛋白质或酶的稳定性 414

9.4.2　减少重组多肽链的错误折叠 418

9.4.3　改善酶的催化活性 418

9.4.4　消除酶的被抑制特性 420

9.4.5　修饰酶的催化特异性 422

9.4.6　强化配体与其受体的亲和性 424

9.4.7　降低异源蛋白药物的免疫原性 427

10.1　途径工程的基本概念 429

10.1.1　途径工程的基本定义 429

10　第三代基因工程——途径工程 429

10.1.2　途径工程的基本过程 431

10.1.3　途径工程的基本原理 433

10.2　途径工程的研究战略 434

10.2.1 在现存途径中提高目标产物的代谢流 434

10 2.2　在现存途径中改变物质流的性质 437

10.2.3　利用已有途径构建新的代谢旁路 438

10.3　初级代谢的途径工程 440

10.3.1 乙醇生产菌的途径操作 440

10.3.2　辅酶Q生产菌的途径操作 447

10.3.3　氢气生产菌的途径操作 453

10.4　次级代谢的途径工程 454

10.4.1 聚酮生物合成的分子机制 455

10.4.2　聚酮合酶各组成模件的操作战略 455

10.4.3　聚酮生物合成基因的异源表达 458

参考文献 461