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第一章 基因与基因工程 1

第一节 基因研究的发展 1

1.基因学说的创立 1

2.基因与DNA分子 3

3.基因与DNA的多核苷酸区段 5

4.基因与多肽链 6

5.基因的碱基顺序与蛋白质的氨基酸顺序 7

6.基因的结构 10

7.基因的表达与调控 12

8.基因的分离 14

9.基因的合成 16

第二节 基因的现代概念 17

1.移动基因 17

（1）插入序列 18

（2）转位子 20

（3）转位作用 21

（4）逆转位子 22

2.断裂基因 22

（1）断裂基因的发现 23

（2）间隔子位置的测定 23

（3）间隔子及表达子的一般特点 24

（4）mRNA初级转录本的剪辑 25

3.假基因 28

（1）重复的假基因 28

（2）加工的假基因 29

4.重复序列及重复基因 30

（1）唯一序列及低度重复序列 31

（2）中度重复序列 32

（3）高度重复序列 33

5.重叠基因 34

第三节 基因工程的诞生及其主要的研究内容 37

1.基因工程的诞生 37

2.基因工程的定义及其主要的研究内容 43

3.有关基因工程安全性的争论 44

4.重组DNA技术的应用与发展 47

第二章 基因操作的主要技术原理 51

第一节 核酸的凝胶电泳 51

1.基本原理 51

2.琼脂糖凝胶电泳 52

3.脉冲电场凝胶电泳 54

第二节 核酸分子杂交 55

1.萨瑟恩DNA印迹杂交 56

2.诺塞恩RNA印迹杂交 59

3.斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 59

4.菌落（或噬菌斑）杂交 60

第三节 细菌转化 61

1.肺炎链球菌的转化 61

2.大肠杆菌的转化 62

3.细菌转化频率 62

第四节 DNA核苷酸序列分析 64

1.Sanger 双脱氧链终止法 65

（1）Sanger双脱氧链终止DNA测序法的原理 65

（2） Sanger双脱氧-M13体系DNA序列分析法 67

（3） Sanger双脱氧-pUC体系DNA序列分析法 69

2.Maxam-Gilbert化学修饰法 71

（1）Maxam-Gilbert化学修饰法的原理 71

（2）碱基特异的化学切割反应 71

（3）Maxam-Gilbert化学修饰-CS载体系统DNA序列分析法 75

（4）Maxam-Gilbert化学修饰法的优点 76

3.DNA序列分析的自动化 76

4.DNA杂交测序 78

（1）DNA杂交测序原理 78

（2）固定DNA或寡核苷酸的矩阵芯片 79

（3）杂交的检测 80

（4）SBH的应用 81

第五节 基因的化学合成 82

1.基因化学合成的概况 82

2.磷酸二酯法合成寡核苷酸 82

3.磷酸三酯法合成寡核苷酸 83

4.固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸 85

5.用寡核苷酸片段组装基因的方式 85

6.寡核苷酸化学合成的实际用途 87

（1）作为合成基因的元件 87

（2）作为核苷酸序列分析的引物 88

（3）作为核酸分子杂交的探针 88

（4）用于基因定点诱变研究 88

（5）作为PCR扩增反应的引物 89

（6）作为重组DNA连接构件 89

第六节 基因定点诱变 89

1.盒式诱变 89

2.寡核苷酸引物诱变 92

（1）寡核苷酸引物诱变原理 92

（2）寡核甘酸引物诱变过程 93

（3）寡核苷酸引物诱变法的局限性 95

（4）提高寡核苷酸引物突变效率的办法 95

3.PCR诱变 97

（1）重组PCR定点诱变法 97

（2）大引物诱变法 99

第七节 基因扩增 99

1.PCR技术的基本原理及特点 100

2.Taq DNA聚合酶 103

3.寡核苷酸引物 105

（1）引物的长度 105

（2）简并引物 106

（3）嵌套引物 107

4.PCR技术的研究应用 107

（1）基因组克隆 107

（2）反向PCR与染色体步移 107

（3）不对称PCR与DNA序列测定 108

（4）RT-PCR与RNA分析 110

（5）基因的体外诱变与突变的检测 112

（6）基因组的比较研究 112

第八节 研究DNA与蛋白质相互作用的方法 113

1.凝胶阻滞试验 114

2.DNasel足迹试验 114

3.甲基化干扰试验 117

4.体内足迹试验 119

第三章 基因克隆的酶学基础 121

第一节 核酸内切限制酶与DNA分子的体外切割 122

1.寄主控制的限制与修饰现象 122

2.核酸内切限制酶的类型 124

3.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的基本特性 128

4.Ⅱ型核酸内切限制酶的基本特性 129

（1）基本特性 129

（2）同裂酶 130

（3）同尾酶 131

（4）限制片段末端的连接作用 131

5.核酸内切限制酶的命名法 133

6.影响核酸内切限制酶活性的因素 134

（1）DNA的纯度 134

（2）DNA的甲基化程度 134

（3）酶切消化反应的温度 135

（4）DNA的分子结构 135

（5）核酸内切限制酶的缓冲液 136

7.核酸内切限制酶对DNA的消化作用 136

（1）核酸内切限制酶与靶DNA识别序列的结合模式 136

（2）核酸内切限制酶对DNA分子的局部消化问题 136

（3）核酸内切限制酶对真核基因组DNA的消化作用 137

第二节 DNA连接酶与DNA分子的体外连接 137

1.DNA连接酶 138

2.粘性末端DNA片段的连接 140

3.平末端DNA片段的连接 141

（1）同聚物加尾法 141

（2）衔接物连接法 144

（3）DNA接头连接法 146

4.热稳定的DNA连接酶 150

（1）寡核苷酸连接测定法 150

（2）边接酶链式反应（LCR） 150

第三节 DNA聚合酶 153

1.DNA聚合酶Ⅰ与核酸杂文探针的制备 153

（1）DNA聚合酶Ⅰ 153

（2）DNA缺口转移 156

（3）DNA杂交探针的制备 157

2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段与DNA末端标记 158

3.T4DNA聚合酶和取代合成法标记DNA片段 160

4.依赖于RNA的DNA聚合酶与互补DNA的合成 161

5.T7DNA聚合酶 163

6.修饰的T7DNA聚合酶 163

第四节 DNA及RNA的修饰酶 164

1.末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾 164

2.T4多核苷酸激酶与DNA分子5 -末端的标记 165

3.碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用 167

第五节 核酸外切酶 169

1.核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ） 169

2.核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ） 169

3.λ核酸外切酶（λexo）和T7基因6核酸外切酶 171

第六节 单链核酸内切酶 171

1.S1核酸酶与RNA分子定位 171

2.Bal31核酸酶与限制位点的确定 173

第四章 基因克隆的质粒载体 176

第一节 质粒的一般生物学特性 176

1.质粒DNA 176

2.质粒DNA编码的表型 178

3.质粒DNA的转移 180

（1）质粒的类型 180

（2）F质粒 180

（3）质粒DNA的接合转移 181

4.质粒DNA的迁移作用 183

5.质粒DNA的复制类型 185

6.质粒的不亲和性 186

（1）质粒的不亲和性现象 186

（2）质粒不亲和性的分子基础 187

第二节 质粒DNA的复制与拷贝数的控制 189

1.质粒DNA复制的多样性 189

2.ColE1质粒DNA复制的启动 190

3.质粒DNA拷贝数的控制 190

（1）天然质粒拷贝数的控制 190

（2）杂种质粒拷贝数的控制 191

4.质粒复制控制的分子模型 191

（1）抑制蛋白质稀释模型 191

（2）自体阻遏蛋白质模型 193

第三节 质粒DNA的分离与纯化 194

1.氯化铯密度梯度离心法 195

2.碱变性法 196

3.微量碱变性法 196

4.影响质粒DNA产量的因素 198

（1）寄主菌株的遗传背景 198

（2）质粒的拷贝数及分子大小 199

第四节 质粒载体的构建及类型 199

1.天然质粒用作克隆载体的局限性 199

2.质粒载体必须具备的基本条件 200

3.质粒载体的选择记号 202

4.不同类型的质粒载体 203

（1）高拷贝数的质粒载本 203

（2）低拷贝数的质粒载体 204

（3）失控的质粒载体 204

（4）插入失活型的质粒载体 205

（5）正选择的质粒载体 205

（6）表达型的质粒载体 207

第五节 重要的大肠杆菌质粒载体 208

1.pSC101质粒载本 208

（1）应用pSC101质粒作基因克隆载体的实例一——葡萄球菌质粒基因在大肠杆菌中的表达 209

（2）应用pSC101质粒作基因克隆载体的实例二——在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾DNA 211

2.ColE1质粒载体 211

3.pBR322质粒载体 214

（1）pBR322质粒载体的构建 214

（2）pBR322质粒载体的优点 216

（3） pBR322质粒载体的改良 219

（4）应用pBR322质粒作为基因克隆载体的实例——水稻叶绿体光诱导基因psbA的结构分析 220

4.pUC质粒载体 221

（1） pUC质粒载体的结构 221

（2） pUC质粒载体的优点 223

5.其它重要的质粒载体 224

（1）丧失迁移功能的质粒载体 224

（2）能在体外转录克隆基因的质粒载体 225

（3）穿梭质粒载体 227

第六节 质粒载体的稳定性问题 229

1.质粒载体不稳定性的类型 229

（1）结构的不稳定性 229

（2）分离的不稳定性 230

2.影响质粒载体稳定性的主要因素 230

（1）新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应 230

（2）拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响 232

（3）寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应 232

3.随机分配的分子机理 233

（1）通过精巧的控制环路使质粒拷贝数的差度限制在最低的水平 234

（2）通过位点特异的重组作用消除天然质粒的寡聚体 234

（3）通过调节细胞的分裂活动阻止无质粒细胞的产生 234

（4）大肠杆菌素的合成增进了质粒的稳定性 234

4.主动分配的分子机理 235

（1）分配区的结构与功能 235

（2）预配对模型 236

（3）二聚体的解离有助于质粒的主动分配 237

（4）寄主致死功能对质粒稳定性的效应 238

第五章 噬菌体载体和柯斯载体 240

第一节 噬菌体的一般生物学特性 240

1.噬菌体的结构及其核酸类型 240

2.噬菌体的感染性 240

3.噬菌体的溶菌生命周期 242

4.噬菌体的溶源生命周期 243

（1）若干有关的基本概念 243

（2）溶源周期的主要特征 244

（3）超感染免疫性 245

（4）溶源噬菌体的诱发 246

5.重组噬菌体的分离 247

第二节 λ噬菌体载体 248

1.λ噬菌体的分子生物学概述 249

（1）λ噬菌体基因组的结构 249

（2）λ噬菌体DNA的复制 251

（3）λ噬菌体DNA的整合与删除 251

（4）λ噬菌体DNA的转录与转译 252

2.λ噬菌体载体的构建及其主要类型 253

（1）构建λ噬菌体载体的基本原理 253

（2）λ噬菌体载体的主要类型 255

（3）凯伦噬菌体载体 258

3.λ噬菌体载体的改良 260

（1）Spi-正选择的λ噬菌体载体 260

（2）具有体内删除特性的λ噬菌体载体 262

4.λ重组体DNA分子的体外包装 266

（1）λ重组体DNA分子的转染作用 266

（2）λDNA的体外包装 267

（3）λ噬菌体DNA的包装限制问题 269

5.λ重组噬菌体的成熟 269

6.λ重组体分子的选择方法 270

（1）cl基因功能选择法 270

（2）lacZ基因功能选择法 270

（3）Spi-选择法 271

7.克隆在λ噬菌体载体上的外源基因的表达 271

第三节 柯斯质粒载体 272

1.柯斯质粒载体的构建 272

2.柯斯质粒载体的特点 273

3.柯斯克隆 274

4.柯斯克隆的改良 276

（1）Ish-Horowicz-Burke柯斯克隆方案 276

（2）Bates-swift柯斯克隆方案 278

（3）其它的柯斯克隆方案 279

第四节 单链DNA噬菌体载体 280

1.M13噬菌体的生物学特性 281

2.M13克隆体系 284

（1）β半乳糖苷酶显色反应原理 284

（2）M13载体系列的发展 286

（3）M13载体系列的优点 290

3.噬菌体展示载体 293

第五节 噬菌粒载体 296

1.噬菌粒载体的概念 296

2.pUC118和pUC119噬菌粒载体 297

（1） pUC118和pUC119噬菌粒载体的复制模式 298

（2） pUC118和pUC119噬菌粒载体的优点 299

（3） pUC118和pUC119噬菌粒载体的克隆程序 301

3.pBluescript噬菌粒载体 301

（1）体外转录载体 301

（2） pBluescript噬菌粒载体的结构特征 302

（3） pBluescript噬菌粒载体的体外转录 303

第六章 基因的分离与鉴定 305

第一节 DNA克隆片段的产生与分离 308

1.基因组DNA的片段化 308

（1）利用限制酶片段化基因组DNA的一般问题 308

（2）基因组DNA的双酶消化策略 309

2.DNA片段的大小分部 309

3.编码目的基因的克隆片段的富集 310

第二节 重组体DNA分子的构建及导人受体细胞 310

1.外源DNA片段定同载体分子的重组 312

（1）外源DNA片段定向插入载体分子 312

（2）非互补粘性末端DNA分子间的边接 312

（3）最佳连接反应 314

2.重组体分子导入受体细胞的途径 316

（1）重组体DNA分子的转化或转染 317

（2）体外包装的λ噬菌体的转导 318

第三节 基因克隆的实验方案 319

1.互补作用基因克隆 321

2.cDNA基因克隆 322

（1）DNA文库的构建 322

（2）不同车度mRNA的cDNA克隆 327

（3）全长cDNA合成 331

（4）cDNA克隆的优越性 334

3.基因组DNA克隆 335

（1）应用λ噬菌体裁体构建基因组文库 336

（2）应用柯斯质粒载体构建基因组文库 337

4.基因定位克隆 340

（1）拟南芥菜简介 341

（2）RFLP分子标记 342

（3）RFLP作图的原理与步骤 342

（4）染色体步移 344

（5）大尺度基因组物理图谱的构建 345

第四节 克隆基因的分离 350

1.应用核酸探针分离克隆的目的基因 352

（1）核酸探针的来源 352

（2）寡核苷酸探针的人工合成 353

（3）假阳性克隆的克服 353

2.应用差别杂交或扣除杂交法分离克隆的目的基因 356

（1）差别杂交 356

（2）差别杂交的局限性 358

（3）扣除杂交 358

3.应用mRNA差别显示技术分离克隆的目的基因 359

（1） mRNA差别显示的原理 361

（2） mRNA差别显示实验的基本过程 362

（3） mRNA差别显示法的局限性 362

4.应用表达文库分离克隆的目的基因 364

5.酵母双杂交体系 365

（1）酵母双杂交体系的基本原理 365

（2）酵母双杂交体系的寄主菌株及质粒载体 365

（3）酵母双杂交体系的实验程序 368

第五节 重组体分子的选择与鉴定 369

1.遗传检测法 370

（1）根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法 370

（2）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 374

2.物理检测法 375

（1）凝胶电泳检测法 375

（2）R-环检测法 375

3.菌落或噬菌斑杂交筛选法 375

4.免疫化学检测法 376

（1）放射性抗体检测法 378

（2）免疫沉淀检测法 380

（3）表达载体产物之免疫化学检测法 380

5.DNA-蛋白质筛选法 382

6.转译筛选法 382

（1）杂交抑制的转译 382

（2）杂交选择的转译 384

索引 385