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绪论 1

一、基因工程的理论和技术基础及工作程序 1

二、基因工程技术的建立与发展 2

三、基因工程的产业化及应用 6

四、转基因生物的安全性 9

第一章 基因工程的分子遗传学基础 12

第一节 基因和信息流 12

一、基因的概念 12

二、遗传的中心法则 12

三、基因表达的调节——操纵子模型 14

第二节 核酸的生物化学 18

一、核酸大分子的结构 18

二、DNA双螺旋的变性与复性 19

第三节 分子杂交 21

一、原位分子杂交 21

二、芯片技术 23

三、印迹杂交 23

四、异源双链定位法和R环定位法 26

第四节 基因工程中常采用的酶类 27

一、序列特异的DNA限制性酶 27

二、连接酶和激酶 29

三、DNA聚合酶和RNA聚合酶 30

第五节 研究DNA和RNA的方法 30

一、核酸的分离纯化 30

二、电泳 30

三、DNA测序 36

四、体外突变 39

第六节 实例1：鉴别特定基因转录物的转录起始点 45

一、研究目的 45

二、已知的信息和试剂 45

三、基本策略 45

四、注释 46

五、可供参考的思路 48

习题 48

第二章 原核生物分子克隆的宿主和载体系统 51

第一节 应用广泛的宿主菌 51

一、E.coli K-12的生物学 51

二、细菌的限制与修饰系统 51

三、大肠杆菌的克隆载体 53

第二节 质粒载体 53

一、质粒生物学 53

二、质粒上常编码抗生素抗性基因 54

三、质粒DNA克隆载体 55

四、通过转化将DNA转移到大肠杆菌中 56

第三节 噬菌体克隆载体 58

一、λ噬菌体的生物学 58

二、λ噬菌体克隆载体 59

三、M13噬菌体克隆载体 60

第四节 基因组DNA克隆载体 63

一、黏粒载体 63

二、酵母人工染色体载体 64

三、细菌人工染色体载体 65

四、P1噬菌体载体和P1人工染色体 66

五、哺乳动物人工染色体载体 68

第五节 外源DNA和载体连接的方法 68

一、外源DNA和载体连接方法的分类 68

二、定向克隆 70

第六节 实例2：拟南芥肌钙网蛋白基因在E.coli中的调节表达 70

一、研究目的 70

二、已知的信息和试剂 70

三、基本策略 71

四、注释 73

五、可供参考的思路 73

习题 73

第三章 基因文库的构建和筛选 75

第一节 基因文库的构建 75

一、基因组文库和cDNA文库 75

二、构建基因文库的克隆载体和筛选策略 77

三、亚克隆 80

第二节cDNA文库的构建和筛选 81

一、mRNA的分离纯化 82

二、cDNA合成 83

三、cDNA克隆载体 86

第三节cDNA文库的筛选 88

一、简并寡核苷酸探针 88

二、抗体探针 90

三、差示杂交 92

四、扣除杂交 92

第四节cDNA表达文库的功能筛选 94

一、蛋白质活性分析 94

二、酵母双杂交系统 95

三、cDNA噬菌体展示技术 97

第五节 用克隆cDNA作为反应物 99

一、RNA印迹 99

二、RNase保护法 100

三、核连缀（转录）分析 100

第六节 实例3：体外克隆编码细胞内信号蛋白的基因 101

一、研究目的 101

二、可利用的信息和资源 102

三、基本策略 102

四、注释 102

五、可供参考的思路 102

习题 104

第四章 基因组DNA的分析 106

第一节 基因组作图 106

一、遗传图和细胞学图 106

二、物理图 108

三、基因定位 116

第二节 基因组长DNA片段的操作 120

一、用荧光激活细胞分拣法来分拣染色体 121

二、标签克隆法 121

三、用DNA池来筛选基因组文库 122

第三节 基因调节序列作图 123

一、用体外表达进行基因调节序列作图 123

二、定位蛋白质结合位点的分析方法 124

三、电泳迁移率变动分析 126

第四节 实例4：通过定点克隆分离一个人类致病基因 127

一、研究目的 127

二、已知的信息和试剂 127

三、基本策略 128

四、注释 128

五、供参考的思路 128

习题 128

第五章 聚合酶链反应与连接酶反应 135

第一节 基本的PCR方法 135

一、PCR扩增循环 136

二、PCR需用的DNA聚合酶 137

三、PCR引物设计 138

四、两个引物间的最佳距离 139

五、PCR实验的最优化 140

第二节 反转录PCR 141

一、cDNA末端快速扩增 141

二、定量RT-PCR 142

三、差异表达基因的扩增 144

四、抑制性消减杂交 145

五、肠道细菌基因间重复保守序列-聚合酶链反应 147

第三节 PCR用于诊断 147

一、在组织样本中检测病原体 148

二、用序列标签位点进行基因型分型 148

第四节 PCR在实验室中的应用 149

一、用PCR亚克隆靶DNA 149

二、PCR介导产生融合基因 151

第五节 其他的DNA扩增和靶序列的检测方法 152

一、连接酶链反应 152

二、连接酶检测反应 153

三、缺口-连接酶链反应 153

四、不对称缺口连接酶链反应 154

五、解链酶扩增 156

第六节 实例5：用RT-PCR克隆细胞特异转录本 156

一、研究目的 156

二、可利用的信息和试剂 156

三、基本策略 157

四、注释 157

五、可供参考的思路 158

习题 159

第六章 培养细胞中克隆基因的表达 161

第一节 基因调控的研究 161

一、表达载体 161

二、报道基因 162

三、反义技术 167

四、RNA干扰 169

第二节 基因在细胞系中表达的方法 171

一、基因转染的策略 172

二、瞬时转染 172

三、稳定转染 173

第三节 用酵母作为模式真核细胞 176

第四节 蛋白质在培养细胞中的表达 177

一、E.coli表达系统 177

二、杆状病毒表达系统 177

第五节 实例6：启动子选择转录因子的研究 180

一、目的 180

二、可利用的信息和试剂 180

三、基本策略 180

四、注释 181

五、可供参考的思路 183

习题 183

第七章 转基因动植物 184

第一节 果蝇发育的分子生物学 184

一、P因子介导的转化 184

二、P因子增强子阱载体 185

三、可介导转化的其他真核转座因子 187

第二节 构建转基因的农作物 188

一、根癌农杆菌介导的基因转移 189

二、用基因枪制备转基因水稻和玉米 191

第三节 转基因小鼠 193

一、用受精卵细胞制备转基因小鼠 193

二、通过干细胞的同源重组进行基因敲除 195

三、人类疾病的转基因小鼠模型 199

第四节 转基因家畜 200

一、用转基因动物制备药物 201

二、动物的体细胞克隆 202

第五节 实践7：敲除转基因鼠产生特异基因 206

一、研究目的 206

二、可利用的信息和试剂 206

三、基本策略 206

四、注释 207

五、可供参考的思路 208

习题 208

第八章 人类基因鉴定和基因诊断 211

第一节 内源基因突变引起的人类疾病 211

一、基因点突变和移码突变所导致的遗传病 211

二、基因的缺失、重复和重排导致的遗传病 212

三、动态突变 214

四、癌基因突变和人类的肿瘤 216

五、基因印记 219

第二节 病毒感染引起的人类严重疾病 221

一、禽流感 221

二、SARS 222

三、艾滋病 222

四、普里昂病 223

第三节 基因定位、鉴别和诊断 225

一、致病基因的定位 225

二、不同类型基因突变的检测 227

三、缺失和重复的检测 233

四、基因重排的检测 235

五、基因印记变异的检测 236

六、DNA三核苷酸扩增的检测 237

七、病原体的基因检测 237

八、癌基因和抗癌基因突变的检测 242

第四节 产前诊断和设计婴儿 244

一、产前诊断 244

二、设计婴儿 246

第五节 携带者的检出 247

第六节 实例8：奥尔波特综合征的检测 248

一、研究目的 248

二、可利用的信息和试剂 248

三、基本策略 248

四、注释 248

五、思路扩展 249

习题 249

第九章 基因治疗 251

第一节 基因治疗的策略 251

一、体细胞基因治疗的策略 251

二、基因治疗的关键步骤 253

三、基因治疗的靶细胞选择 254

四、体细胞基因治疗的途径 254

第二节 基因转移的方法 256

一、基因转移的非生物方法 256

二、基因转移的病毒方法 257

第三节 基因治疗药物 262

一、p53基因 262

二、siRNA 263

三、反义RNA 265

四、核酶 265

五、肽核酸 268

六、三链DNA 269

七、自杀基因 271

八、短片段同源序列的更换技术 271

九、激活小RNA 272

第四节 基因治疗的安全性 274

第五节 基因治疗的新方法 275

一、基因组编辑核酸酶 275

二、干细胞介导重编程 283

三、通过核抑制治疗线粒体病 291

第六节 实例9：利用ipSC治疗艾滋病 291

一、研究目的 291

二、可利用的信息和试剂 292

三、基本策略 292

四、注释 292

五、可供参考的思路 293

习题 293

主要参考文献 294

索引 297