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第一章 绪论 1

第一节 分子生物学技术的历史和意义 1

一、医学分子生物学是分子生物学的重要分支 1

二、基因操作是所有分子生物学技术的核心 1

三、蛋白质研究较基因操作更为复杂 2

第二节 医学分子生物学实验设计 3

一、研究课题的选择 3

二、研究策略和技术路线设计 4

三、实验方法选择原则 4

四、实验设计注意事项 5

五、实验数据的整理和分析 5

第三节 分子生物学实验实施 6

一、实验室基本设备需求 6

二、实施实验的细节 6

三、实验室安全 7

第二章 聚合酶链反应 8

第一节 PCR技术概述 8

一、PCR技术的发展历程及科学价值 8

二、PCR技术的基本原理 9

三、PCR反应体系 9

四、PCR反应的基本步骤 10

第二节 PCR的引物设计和反应条件优化 11

一、PCR引物的设计 11

二、PCR反应条件的优化 11

第三节 PCR技术的基本类型及应用 12

一、PCR技术的主要类型 12

二、PCR技术的实际应用 15

第四节 PCR产物的定性和定量检测方法 17

第五节 实时定量PCR 18

一、实时定量PCR技术的原理 18

二、应用于实时定量PCR中的荧光探针与荧光染料 20

三、实时定量PCR的实验流程 21

四、实时定量PCR常见问题及优化方案 22

五、实时荧光定量PCR的国际化标准 23

六、实时定量PCR技术在医学上的应用 25

第三章 DNA体外重组 27

第一节 基本流程和必备工具 27

一、基本流程 28

二、常用工具酶 28

三、基因载体 31

第二节 DNA重组前的准备工作 34

一、选择载体 34

二、载体的准备 35

三、目的DNA的结构设计 36

第三节 目的DNA片段的获取及准备 36

一、获取DNA片段的方法选择 36

二、DNA片段的末端处理 38

第四节 DNA片段与载体的重组 38

一、DNA片段与载体的连接方式 38

二、连接反应时需要考虑的一些因素 40

三、非酶切DNA体外重组 41

第五节 重组DNA的克隆化及鉴定 41

一、重组DNA转化大肠埃希菌 41

二、重组DNA的克隆筛选及鉴定 43

第四章 DNA序列分析技术 46

第一节 DNA测序技术的发展 46

一、第一代测序技术 46

二、第二代测序技术 47

三、第三代测序技术 47

第二节 常规DNA序列测定的原理 47

一、双脱氧测序法的原理 47

二、Maxam-Gilbert化学降解法测序的原理 48

第三节 自动激光荧光DNA测序——第一代测序技术 48

一、自动激光荧光DNA测序的基本原理 48

二、自动激光荧光DNA测序的基本程序 49

三、自动激光荧光DNA测序的注意事项 50

第四节 其他DNA序列分析新技术 51

一、焦磷酸测序 51

二、循环芯片测序——第二代测序技术 52

三、单分子测序——第三代测序技术 55

第五节 对所获 DNA序列的初步分析 57

一、同源序列比对和限制性内切核酸酶位点分析 57

二、外显子／内含子边界分析 57

三、开放阅读框分析 57

四、转录起点、启动子以及转录因子结合位点分析 57

第五章 基因突变技术 59

第一节 体外基因突变 59

一、体外基因突变的原理和应用 59

二、体外基因突变的策略和步骤 60

第二节 模式生物的基因组诱变 63

一、基因组诱变的基本原理及应用 63

二、利用ENU诱变的基本策略及流程 64

三、利用转座子诱变的基本策略及流程 65

第六章 核酸分子杂交 68

第一节 核酸探针及其标记 68

一、探针的种类及其选择 69

二、核酸标记物及其选择 69

三、核酸探针的标记方法 71

四、标记探针的纯化 74

第二节 Southern印迹杂交 74

一、固相支持物与印迹方法的选择 74

二、Southern印迹杂交的基本过程 76

三、Southern印迹杂交的注意事项 78

第三节 Northern印迹杂交 78

一、Northern印迹杂交的基本过程 79

二、Northern印迹杂交的注意事项 79

第四节 其他核酸分子杂交 80

一、斑点杂交与狭缝印迹杂交 80

二、原位杂交 80

三、液相分子杂交 81

第七章 外源基因在原核细胞的表达 83

第一节 常用表达系统及其选择 84

一、大肠埃希菌表达系统 84

二、芽胞杆菌表达系统 86

三、链霉菌表达系统 86

第二节 外源基因的表达和鉴定 87

一、蛋白质在原核细胞中的表达特点 87

二、包含体的形成、变性与复性 87

三、蛋白质在原核细胞表达的调控 88

四、外源基因在原核细胞中表达的鉴定 89

第三节 外源基因表达条件和优化 89

一、表达载体的优化设计与选择 89

二、增加mRNA的稳定性 90

三、提高外源蛋白的稳定性 90

四、选择合适的宿主菌 90

第四节 外源基因原核表达的基本操作 90

一、获得目的基因并克隆入原核表达载体 91

二、工程菌的构建 91

三、产物的表达与鉴定 91

四、作为基因重组药物的样品检定 92

第五节 无细胞表达系统 92

一、无细胞表达系统的类型 93

二、无细胞表达系统的操作 93

三、无细胞表达系统的应用 94

第八章 外源基因在真核细胞中的表达 95

第一节 真核表达外源基因的系统和方式 95

一、常用表达载体和宿主 95

二、外源基因在真核细胞中表达的主要方式 95

三、外源基因在真核细胞中表达的鉴定 96

第二节 真核细胞基因导入方法 96

一、物理方法 96

二、化学方法 96

三、病毒感染法 97

第三节 外源基因在酵母细胞中的表达 97

一、常用的酵母细胞表达载体 97

二、酵母表达系统中的宿主 97

三、酵母系统表达外源蛋白质的相关技术操作 98

第四节 外源基因在昆虫细胞中的表达 99

一、常用的昆虫表达系统 99

二、昆虫表达系统中的宿主及其特点 99

三、昆虫系统表达外源蛋白质的主要步骤 100

第五节 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 101

一、常用的哺乳动物细胞表达载体 101

二、常用哺乳动物细胞表达的宿主 102

三、哺乳动物细胞表达外源蛋白质产物的主要操作 103

四、哺乳动物细胞表达系统用于制备和生产重组蛋白质产品 104

第九章 蛋白质的分离纯化 106

第一节 生物样品的预处理 106

一、机械破碎法 106

二、超声破碎法 107

三、反复冻融法 107

四、表面活性剂裂解及酶解法 107

第二节 蛋白质样品的粗分离 108

一、离心分离 108

二、透析和超滤 108

三、沉淀 108

第三节 蛋白质的层析纯化 109

一、凝胶过滤层析 110

二、离子交换层析 111

三、亲和层析 115

四、疏水作用层析 116

第四节 蛋白质的电泳分离 117

一、聚丙烯酰胺凝胶电泳 117

二、等电聚焦电泳 118

三、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 120

第五节 特殊蛋白质的分离纯化 120

一、包含体蛋白质的提取和纯化 120

二、膜蛋白的提取和纯化 121

三、蛋白质的脱盐和浓缩 121

四、蛋白质的干燥和保存 121

第六节 蛋白质分离纯化的综合策略 121

一、基于蛋白质来源的考虑 121

二、基于纯化日的的考虑 122

二、基于纯度和成本的考虑 122

第十章 蛋白质的定性定量分析 124

第一节 蛋白质分子量的测定 124

一、SDS-PAGE法测定蛋白质的相对分子量 124

二、凝胶过滤层析法测定蛋白质相对分子量 126

三、质谱法测定蛋白质精确分子量 127

第二节 蛋白质的等电点测定 128

一、等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理 128

二、等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的操作 128

第三节 蛋白质总含量测定 129

一、凯氏定氮法 129

二、Lowry法 129

三、二喹啉甲酸法 131

四、考马斯亮蓝法 131

五、紫外光谱吸收法 132

第四节 特定蛋白质的定性和定量分析 132

一、细胞可溶性蛋白质的含量测定 132

二、细胞分泌蛋白的含量测定 139

三、膜蛋白的含量测定 141

第五节 蛋白质半衰期测定 142

一、脉冲追踪标记法 142

二、放线菌酮阻断法 143

第十一章 蛋白质的化学修饰分析 145

第一节 蛋白质磷酸化分析 145

一、放射性核素示踪法用于蛋白质磷酸化分析 146

二、抗磷酸化氨基酸抗体用于蛋白质磷酸化分析 149

三、蛋白质磷酸化的规模化分析 150

第二节 蛋白质糖基化分析 151

一、酶解释放法鉴定糖蛋白 151

二、糖基化抑制剂用于鉴定糖蛋白 153

三、凝集素结合法富集和鉴定糖蛋白 154

四、单糖放射性核素示踪法 154

五、糖蛋白的规模化研究技术 154

第三节 其他蛋白质共价修饰分析 155

一、蛋白质泛素化分析 155

二、组蛋白的乙酰化和甲基化分析 157

第十二章 蛋白质的空间结构分析 159

第一节 蛋白质空间结构解析的X-射线晶体学技术 160

一、基本原理 160

二、晶体结构解析步骤 161

第二节 蛋白质溶液结构解析的核磁共振波谱学技术 162

一、基本原理 162

二、核磁共振溶液结构解析步骤 163

第三节 蛋白质空间结构的低温电镜三维重构技术 166

一、基本原理 166

二、低温电镜三维重构解析步骤 167

第四节 蛋白质空间结构预测及建模 169

一、蛋白质二级结构预测 169

二、蛋白质三级结构建模 169

三、蛋白质复合体结构的分子对接 170

第十三章 蛋白质相互作用研究技术 171

第一节 酵母双杂交法 171

一、酵母双杂交系统的基本原理和用途 171

二、酵母双杂交的主要实验步骤 173

三、酵母双杂交系统中的常见问题与解决方案 176

四、逆向双杂交系统和三杂交系统 177

第二节 标签融合蛋白结合实验 177

一、标签融合蛋白结合实验基本步骤 177

二、标签融合蛋白结合实验常见问题的解决与改进 178

第三节 免疫共沉淀分析 179

一、基本原理和主要步骤 179

二、几种特殊的免疫共沉淀技术 180

三、免疫共沉淀的常见问题及解决办法 181

第四节 物理学方法研究蛋白质-蛋白质相互作用 182

一、荧光共振能量转移技术 182

二、共振光散射技术和表面等离子共振技术 185

三、共定位荧光染色技术 187

第五节 蛋白质-蛋白质相互作用预测方法 189

第十四章 蛋白质组学研究相关技术 191

第一节 基于双向电泳-质谱的蛋白质组研究策略 191

一、双向凝胶电泳 191

二、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定蛋白质 193

第二节 基于多维层析-质谱的蛋白质组研究策略 194

一、蛋白质样品制备与酶解 194

二、肽混合物层析分离技术及进展 195

三、电喷雾串联质谱鉴定蛋白质 196

第三节 定量蛋白质组学研究技术 196

一、荧光双向差异凝胶电泳技术 197

二、细胞培养氨基酸代谢稳定核素标记技术 197

三、核素辅助多重化学标记技术 197

四、无标记定量技术 198

五、基于质谱和核素标记辅助的绝对定量技术 198

第四节 翻译后修饰蛋白质组研究技术 199

一、翻译后修饰蛋白质富集与分离技术 199

二、翻译后修饰蛋白质质谱鉴定技术 200

第五节 蛋白质组学数据分析工具 200

一、质谱数据鉴定、分析方法和工具 200

二、蛋白质组数据功能注释与分析方法 203

三、蛋白质组整合软件包 203

第十五章 物质代谢与代谢组学研究相关技术 205

第一节 代谢途径中的关键酶活性和代谢产物分析 205

一、葡萄糖代谢关键酶活性和代谢产物分析 206

二、脂肪代谢产物分析 209

三、氨基酸代谢产物分析 210

四、活性氧自由基和清除体系活性分析 211

第二节 代谢途径物流分析 211

一、葡萄糖摄取能力分析及意义 212

二、细胞氧耗分析 212

三、细胞内pH值分析 212

四、ATP含量分析 213

五、CO2含量分析 213

六、线粒体代谢状态分析 213

第三节 代谢组学研究 214

一、代谢组学研究对象和应用领域 215

二、代谢组研究方法 215

第十六章 基因表达谱分析 218

第一节 基因表达谱分析的基本方法 218

一、基因芯片技术 219

二、基因表达系列分析 219

三、用于表达谱分析的基因测序技术 220

第二节 基因芯片的原理及应用 221

一、基因芯片的工作原理 221

二、基因芯片技术的基本流程 222

三、基因芯片的应用 224

第三节 基因芯片的数据挖掘 225

一、生物信息学数据库 225

二、基因芯片数据挖掘的常用方法 226

第四节 蛋白质芯片的原理及应用 227

一、蛋白质芯片的原理和实验流程 228

二、蛋白质芯片的分类及应用 228

第十七章 基因转录调控分析 230

第一节 转录调节蛋白与DNA的结合分析 230

一、凝胶迁移或电泳迁移率实验 230

二、染色质免疫沉淀技术 233

第二节 启动子转录活性分析 235

一、报告基因技术 235

二、核实时转录分析技术 238

三、 cDNA的5′-端快速扩增技术 239

四、基于Ga14的DNA结合蛋白分析技术 240

第三节 DNA甲基化分析 240

一、甲基化特异性PC R 241

二、亚硫酸盐修饰后基因组测序 243

三、DNA甲基化检测的其他方法 244

第四节 芯片技术在基因表达调控研究中的应用 244

一、染色质免疫共沉淀-芯片技术 245

二、染色质免疫共沉淀-序列分析技术 245

三、染色质构象捕获技术 245

第十八章 非编码RNA研究策略与方法 247

第一节 miRNA的研究策略及相关技术 247

一、miRNA的发现与克隆 247

二、miRNA定量检测方法及其选择 248

三、miRNA靶基因的预测与证实 252

四、miRNA的功能研究 253

第二节 siRNA的设计与应用 256

一、应用siRNA的目的与原理 256

二、siRNA的设计与合成 257

三、siRNA的体内外递送方式 257

第三节 长链非编码RNA的研究策略及相关技术 258

一、IncRNA与蛋白质相互作用的研究方法 258

二、IncRNA的生物信息学研究方法 260

第十九章 疾病相关基因的鉴定和分析 261

第一节 鉴定和分析疾病相关基因的策略 261

一、疾病相关基因鉴定的基本原则 261

二、DNA标记的概念 261

三、连锁分析进行基因定位 262

四、关联分析 262

五、动物模型 263

第二节 基因分型 263

一、SNP分型 263

二、STR分型 265

三、CNV分型 266

第三节 突变基因的检测 267

一、以PCR为基础的检测方法 267

二、以核酸杂交为基础的检测方法 268

第二十章 遗传修饰动物的设计和应用 270

第一节 小鼠实验的一般要求 270

一、小鼠实验室的建立 270

二、小鼠的基本饲养条件 271

三、小鼠的日常管理 271

四、小鼠培育 272

第二节 转基因小鼠 272

一、转基因载体的构建 273

二、受精卵的显微注射和移植 274

三、转基因小鼠的鉴定和进一步培育 276

四、转基因小鼠的表型分析 277

第三节 基因剔除小鼠 277

一、基因剔除载体的设计和构建 278

二、在ES细胞进行基因打靶 280

三、ES细胞注射入囊胚和囊胚的移植 283

四、基因剔除小鼠的基因型和表型分析 283

第二十一章 基因功能的研究策略 284

第一节 从分子水平研究基因产物的功能特点 285

一、网络数据可用于蛋白质功能的预测 285

二、细胞内定位为基因表达产物的功能提供基本线索 285

三、基因表达的定性定量分析是基因功能及其调控的重要数据 286

四、定点突变是蛋白质功能的重要证据 287

五、相互作用分子是蛋白质功能的重要提示 287

第二节 从细胞水平研究基因产物的作用机制 287

一、表达和纯化蛋白质作为细胞调节的刺激信号 287

二、在细胞内过表达特定基因以研究其功能 287

三、通过降低基因的表达水平分析基因表达产物在细胞中的作用 288

四、通过下游分子验证基因表达产物的功能 289

第三节 从整体水平研究基因产物的生物学效应 289

一、基因表达产物的体内分布特征 289

二、基因在生理或病理过程中的表达分析 289

三、基因敲除与敲入 290

四、体内表达基因 290

附录Ⅰ分子生物学实验设计中的常见错误 291

附录Ⅱ分子生物学实验微量操作技巧 295

附录Ⅲ 分子生物学实验教学实施方案 298

实验一BCA法测定蛋白质的含量 298

实验二 蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 299

实验三 血清清蛋白、γ-球蛋白的分离纯化 300

实验四 组织DNA与RNA的分离与提取 301

实验五 碱裂解法提取质粒DNA 302

实验六 紫外分光光度法测定核酸含量 303

实验七 聚合酶链反应 303

实验八DNA重组 304

实验九 蛋白质印迹 305

附录Ⅳ分子生物学实验资料参考 307

中英文名词对照索引 326