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第一篇 酶学篇 2

第一章 基因工程核酸酶简介 2

第一节 基因工程核酸酶概况 2

第二节 基因工程核酸酶 2

一、锌指核酸酶 2

二、归巢核酸酶 6

三、TALE核酸酶 7

四、CRISPR/Cas 13

五、三种核酸酶在基因治疗领域的比较 18

第二章 归巢内切酶 21

第一节 归巢内切酶概况 21

第二节 归巢内切酶 22

一、归巢内切酶家族 22

二、归巢内切酶剪切机制 23

三、归巢内切酶克隆与组装 25

四、归巢内切酶在基因操作和重组中的应用研究 27

第三章 利用锌指核酸酶技术的基因治疗研究进展 30

第一节 锌指核酸酶概况 30

第二节 ZFN作用原理 31

第三节 ZFN的应用和限制 33

第四节 ZFN构建的技术改进 36

一、ZFP结合域技术改进 37

二、报告、筛选系统改进 40

三、Fok Ⅰ切割结构域技术改进 41

四、ZFN定点修饰技术改进 42

五、ZFN转染细胞技术改进 43

六、脱靶位点检测改进 44

第四章 TALE文库构建与TALENs相关基因治疗研究 48

第一节 TALENs简介及研究背景 48

一、TALENs简介 48

二、TALENs的基因治疗作用 50

三、TALENs的应用价值 53

第二节 国内外研究现状和发展趋势 54

一、遗传病基因治疗的现状和发展趋势 54

二、基因剪辑的现状和发展趋势 57

三、TALENs克隆及基因剪辑效率和特异性研究现状与发展趋势 59

四、TALENs的应用研究进展和趋势 60

第五章 反因子核酸酶的设计与组装 63

第一节 TALE密码、晶体结构与应用 64

一、TALE密码 64

二、TALE晶体结构 66

三、TALE的应用 66

第二节 TALENs靶点的设计和合成方法 67

一、TALENs靶点的设计 67

二、TALENs组装构建方法 70

第六章 反因子核酸酶活性检测 81

第一节 luciferase SSA法 81

第二节 细胞内源基因突变率检测法 86

一、非配对内切酶法-T7E1法或Cel Ⅰ法 86

二、限制性内切酶法 88

第三节 融合荧光法 89

第四节 原核蓝/白与白/蓝系统法 90

第七章 高通量测序技术在反因子核酸酶酶活性与脱靶效应检测中的应用 93

第一节 反因子核酸酶概况 93

第二节 反因子核酸酶活性与脱靶效应检测 94

一、反因子核酸酶的构建与表达 94

二、反因子核酸酶作用后的突变分析 94

三、高通量测序技术在反因子核酸酶活性与脱靶效应检测中的优越性 101

第二篇 技术篇 104

第八章 反向遗传学在斑马鱼研究中的应用 104

第一节 反向遗传学在斑马鱼研究中的技术概况 104

第二节 靶基因的筛选 105

第三节 MO基因敲降 106

第四节 反向遗传工具的基因组大范围筛选 108

一、反转录病毒插入 108

二、TILLING 108

第五节 ZFN 109

第六节 TALEN——最具前景的反向遗传学工具 110

一、TALE的组成 111

二、TALEN靶位点的选择 112

三、人工构建TALE重复序列的策略 114

四、TALEN诱变的检测方法 116

五、TALEN技术的应用 118

六、TALEN技术的待解决问题 120

第七节 CRISPR/Cas9系统 121

一、CRISPR/Cas9的起源 121

二、CRISPR/Cas9系统的工作原理 121

三、CRISPR/Cas9系统的优点 123

四、设计CRISPR/Cas9系统的原则以及操作事项 124

五、CRISPR/Cas9系统的应用 124

第八节 总结与展望 125

第九章 反因子核酸酶（TALENs）在果蝇基因组修饰中的应用 130

第一节 修饰果蝇基因组的常见技术 130

一、转座元件介导的基因组突变 130

二、同源重组介导的基因打靶 132

三、phiC31定点整合酶介导的多重基因打靶 134

四、锌指核酸酶介导的基因组修饰 135

第二节 转录激活因子样效应蛋白的生物学性质 136

第三节 TALENs介导的基因组操作技术在果蝇中的工作原理 137

一、构建TALEs 137

二、构建TALENs及其体外转录获得mRNAs 139

三、可遗传突变的获得和插入缺失突变的分析 140

第四节 TALENs在果蝇中的应用案例分析 141

第五节 TALENs在果蝇中应用的优势和展望 143

第十章 反因子核酸酶用于人类疾病模型的建立 148

第一节 人类疾病模型简介 148

第二节 应用反因子核酸酶建立人类疾病模型的优势 151

第三节 应用反因子核酸酶建立人类疾病模型的实例（研究进展） 153

第三篇 应用篇 158

第十一章 基因治疗 158

第一节 基因治疗的适应证 158

一、遗传性疾病 158

二、肿瘤 159

三、病毒性感染疾病 160

第二节 基因转移的基本方法 160

一、质粒体DNA直接注射法 161

二、脂质体介导的基因转移 162

三、腺病毒与腺相关病毒作为基因转移的载体 163

四、其他病毒载体 165

第十二章 反因子核酸酶靶向编辑HER-2基因的可行性评价 166

第一节 研究背景 166

一、乳腺癌基因治疗研究的独特社会和生物医学价值 166

二、HER-2作为乳腺癌基因治疗的生物靶标 167

三、新型基因剪辑技术靶向剪切目标序列应用于乳腺癌基因治疗的可行性 169

第二节 研究内容 172

第三节 项目的特色与创新之处 174

一、基因技术 174

二、肿瘤治疗 174

第四节 技术路线图 174

第十三章 多模态成像监测EGFR基因特异性TALENs治疗非小细胞肺癌可行性研究 178

第一节 肺癌治疗现状 178

第二节 TALENs靶向EGFR基因治疗肺癌的实验方案 179

第十四章 基因编辑技术敲除雄激素受体治疗前列腺癌的多模态成像评价 189

第一节 前列腺癌治疗现状 189

第二节 TALENs靶向雄激素受体基因治疗前列腺癌的实验方案 192

第十五章 TALENs基于抗肌萎缩蛋白基因44号外显子缺失的基因治疗策略 199

第一节 工程核酸酶TALENs在基因治疗中的潜力 199

第二节 治疗障碍及DMD的临床特征 202

第三节 多基因治疗策略：从DMD转变为BMD的可能性 204

第十六章 反向基因治疗优势 211

第一节 基因失活的价值 212

第二节 未来的期望——治愈部分疾病 213

第三节 反向基因组学与基因治疗 214

附录一 CCR5与艾滋病的防治 216

附件二 相关英文文献 219