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第一章 基因工程概论 1

第一节 基因及其研究历程 1

一、基因学说的创立 1

二、基因与DNA分子 2

三、基因与DNA核苷酸区段 2

四、基因与蛋白质多肽链 3

五、基因碱基顺序与蛋白质氨基酸顺序 3

六、基因的结构与功能 4

七、基因的表达与调控 6

八、基因的分离与克隆 7

九、基因的构建与表达 8

第二节 基因工程的发展史 9

一、理论上的三大发现 9

二、技术的三大发明 10

三、植物基因工程的发展简史 11

第三节 植物基因工程的概念与主要内容 12

一、植物基因工程的概念和特点 12

二、植物基因工程的主要研究内容 14

第四节 植物基因工程的应用 16

一、植物基因工程的应用现状 16

二、转基因植物商业化中存在的问题 17

一、限制性核酸内切酶（限制酶） 19

第一节 基因工程的工具酶 19

第二章 基因工程的工具 19

二、甲基化酶 22

三、DNA连接酶 23

四、DNA聚合酶 24

五、末端转移酶 27

六、核酸酶 28

第二节 基因工程的载体 29

一、质粒载体 29

二、λ和M13噬菌体载体 31

三、Cosmid（科斯质粒）和phagemid载体系列 33

四、酵母载体 34

五、农杆菌Ti质粒载体 36

六、植物病毒载体 38

第三节 凝胶电泳的基本原理 39

一、凝胶电泳的基本原理 39

二、琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳 39

三、脉冲电场凝胶电泳 40

第四节 植物核酸及蛋白质分离的基本原理 41

一、植物核酸分离的基本原理 41

二、植物组织蛋白质分离的基本原理 45

第五节 分子杂交技术 48

一、Southern DNA印迹杂交 49

三、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 50

二、Northern RNA印迹杂交 50

四、菌落或噬菌斑杂交 51

第六节 PCR基因扩增技术 52

一、PCR原理 52

二、PCR反应体系 53

三、PCR反应条件的选择 54

四、PCR条件的优化 55

第七节 文库构建的基本原理及应用 55

一、基因组文库与cDNA文库 56

三、减法文库（subtractire library） 57

四、亚克隆文库 57

二、克隆文库及表达文库 57

第三章 目的基因分离与克隆 59

第一节 目的基因分离克隆的策略 59

一、基因分离克隆的策略 59

二、基因分离克隆策略的选择 60

第二节 功能蛋白组技术分离基因 61

一、功能蛋白组技术概述 61

二、蛋白质双向电泳技术 62

三、功能蛋白氨基酸序列分析 64

四、功能蛋白基因的分离 64

第三节 基因组策略 68

一、基因组文库 68

二、图位克隆目的基因 73

三、插入突变分离克隆目的基因 78

四、基因组DNA相邻片段的克隆 81

第四节 功能基因组策略 83

一、目的基因的RT-PCR扩增 83

二、mRNA差异显示技术 84

三、PCR法构建抑制减法杂交cDNA文库 86

四、基因表达序列分析（SAGE） 88

五、cDNA末端的快速克隆（RACE技术） 90

第五节 基因芯片技术分离目的基因 92

一、生物芯片概述 92

二、利用基因芯片技术分离目的基因 94

三、基因芯片技术在植物基因工程中的其他应用 97

四、基因芯片技术的发展前景 98

第六节 生物信息学技术在分离克隆基因中的应用 99

一、生物信息学技术概述 99

二、利用生物信息学技术发现和分离目的基因 101

三、生物信息学技术分离目的基因的优点及不足 104

第四章 基因表达载体的构建 105

第一节 基因的表达与调控 105

一、基因表达调控是生命活动的必需 105

二、原核生物的基因表达与调控 106

三、真核生物的基因表达与调控 109

第二节 目的基因的功能与表达分析 114

一、目的基因功能与表达分析的策略 114

二、基因表达载体构建及分析的基本原理 115

第三节 农杆菌Ti质粒转化载体的构建 123

一、根癌农杆菌研究的历史 124

二、Ti质粒的结构 124

三、T—DNA的结构与功能 129

四、利用Ti质粒的转化系统 134

五、Ti质粒载体的构建策略 138

第四节 植物病毒载体的构建 142

一、植物病毒表达载体的类型 142

二、植物病毒载体的应用 143

一、植物基因表达载体构建和优化策略 144

第五节 植物基因表达载体构建实例 144

二、基因表达载体构建的实例 147

三、选择和标记基因的特点与选择 152

第六节 RNA干扰表达载体 156

一、RNAi的分子机制 156

二、RNAi载体的设计及构建 157

三、RNAi的应用前景 159

第五章 植物基因的遗传转化 161

第一节 植物基因转化受体系统 161

一、植物基因转化受体系统的条件 161

二、植物基因转化受体系统的类型及其特性 163

三、植物基因转化受体系统建立的程序 165

四、植物基因转化受体系统建立中常遇到的问题 167

一、农杆菌的生物学特性 169

第二节 农杆菌Ti质粒介导基因转化 169

二、根癌农杆菌的侵染能力及其特异性 170

三、根癌农杆菌的转化策略 172

四、根癌农杆菌转化程序及操作原理 177

五、根癌农杆菌Ti质粒转化的方式 184

六、根癌农杆菌转化系统评价 187

第三节 DNA直接导入的基因转化 187

一、聚乙二醇（PEG）介导的基因转化 188

二、电穿孔法 189

三、基因枪法 191

五、脂质体介导法 195

四、显微注射法 195

第四节 花粉管通道法介导基因转化 196

一、花粉管通道法的技术原理 196

二、花粉管通道法的操作程序 197

三、花粉管通道法的应用 198

第五节 病毒介导的基因转化 199

一、病毒介导转化的技术原理 199

二、病毒介导转化的方法 199

三、病毒介导转化的优缺点 200

第六节 植物基因转化系统的选择 200

一、植物基因转化系统的分析 200

二、植物基因转化系统的选择原则 202

一、农杆菌介导的单子叶植物基因转化 203

第七节 单子叶植物的基因转化 203

二、DNA直接导入法对单子叶植物的基因转化 206

三、种质系统导入法对单子叶植物的基因转化 208

四、单子叶植物转化使用的选择标记及报告基因 208

第六章 转基因植株的鉴定及利用 210

第一节 转基因植株鉴定的策略 210

一、转基因植物的证据 210

二、外源基因检测的方式 210

第二节 报告基因检测 211

一、抗生素 211

三、转基因植株鉴定的步骤 211

二、抗除草剂类 212

三、GUS基因 213

第三节 目的基因的检测与分析 215

一、分子杂交 215

二、转基因植物的PCR—Southern杂交检测 217

三、外源基因表达的RT—PCR检测 218

四、外源基因拷贝数的IPCR检测 219

第四节 目的基因整合的遗传分析 220

一、转基因植物中外源DNA的整合特性 220

二、转基因植物中外源DNA整合的遗传效应 222

三、克服转基因沉默的策略 223

四、转基因植物中外源基因的遗传特性 225

第五节 植物转基因材料在育种中的应用 228

一、回交育种 228

二、转基因材料回交育种的特点 231

第七章 转基因植物研究 233

第一节 转基因植物的现状与发展趋势 233

一、国外转基因植物产业化现状 233

二、国内转基因植物产业化现状 233

三、转基因植物的发展趋势 234

第二节 转基因植物研究的几个重要方向 234

一、植物抗虫基因工程 234

二、抗病毒植物基因工程 238

三、植物抗逆境胁迫的基因工程 240

四、植物基因工程可饲（食）疫苗 244

五、利用转基因植物生产药用蛋白 245

第八章 植物基因工程的安全性评价 247

第一节 基因工程安全性的争论 247

一、问题的由来 247

二、初步对策——安全准则 248

第二节 转基因植物的安全性评价 249

一、为什么要对转基因植物进行安全性评价？ 249

二、转基因植物安全性评价的主要内容 250

三、国内外转基因植物的安全性评价概况 251

第三节 转基因作物——恶魔还是救星 252