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第一章 基因工程概论 1

第一节 基因及其研究历程 1

一、基因学说的创立 1

二、基因与DNA分子 2

三、基因中遗传信息的传递与表达 3

四、基因与蛋白质多肽链 3

五、基因碱基序列与蛋白质氨基酸序列 4

六、基因的结构与功能 4

七、基因的表达与调控 6

八、基因的分离与克隆 7

九、基因的构建与表达 8

第二节 基因工程的发展 9

一、理论上的三大发现 9

二、技术的三大发明 10

三、植物基因工程的发展简史 11

第三节 基因工程的概念与主要内容 12

一、基因工程的概念和特点 12

二、作物基因工程的主要研究内容 13

第四节 作物基因工程的应用 16

一、作物基因工程的应用现状 16

二、转基因作物商业化中存在的问题 18

思考题 18

参考文献 18

第二章 基因工程的工具 20

第一节 植物核酸及蛋白质的分离与制备 20

一、植物核酸的制备 20

二、植物蛋白质的分离与纯化 25

第二节 凝胶电泳的基本原理 28

一、凝胶电泳的基本原理 29

二、琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳 29

三、RNA的变性凝胶电泳 30

四、脉冲电场凝胶电泳 31

五、核酸凝胶电泳的常见问题 32

六、蛋白质的凝胶电泳 33

第三节 基因工程的工具酶 33

一、限制性内切核酸酶（限制酶） 34

二、甲基化酶 37

三、DNA连接酶 37

四、DNA聚合酶 39

第四节 分子杂交技术 43

一、DNA印迹法 43

二、RNA印迹法 45

三、斑点印迹法和狭线印迹法 45

四、菌落印迹或噬菌斑印迹 46

五、基因芯片杂交 47

第五节 PCR基因扩增技术 47

一、PCR的原理 47

二、PCR反应体系 48

三、PCR条件的选择 49

四、PCR条件的优化 50

五、常用PCR技术及其应用 50

第六节 基因工程的载体 51

一、质粒载体 52

二、λ噬菌体和M13噬菌体载体 54

三、cosmid（柯斯质粒）和phagemid载体系列 56

四、酵母载体 58

五、农杆菌Ti质粒载体 60

六、植物病毒载体 62

第七节 文库构建的基本原理及应用 63

一、基因组文库与cDNA文库 64

二、克隆文库及表达文库 65

三、减法文库 65

四、亚克隆文库 65

第八节 核酸与蛋白质测序的原理与技术 65

一、DNA测序技术 65

二、蛋白质测序技术 69

第九节 生物信息学技术 72

一、生物信息学数据库 72

二、数据库查询 73

三、数据库搜索 74

四、基因序列分析 75

五、电子克隆技术 76

思考题 77

参考文献 78

第三章 目的基因的克隆与功能分析 79

第一节 基因组策略 79

一、基因组文库筛选目的基因 79

二、图位克隆目的基因 83

三、突变体分析克隆目的基因 89

四、已知DNA片段侧翼基因组序列的分离 96

第二节 转录组策略 100

一、mRNA差异显示分析筛选目的基因 101

二、cDNA文库筛选目的基因 103

三、基因表达系列分析（SAGE）筛选目的基因 106

四、基因芯片分析筛选目的基因 108

五、cDNA末端的快速克隆（RACE技术） 110

第三节 功能蛋白质组策略分离基因 112

一、功能蛋白质组策略概述 112

二、蛋白质双向电泳技术 113

三、功能蛋白的鉴定及氨基酸序列分析 115

四、功能蛋白基因的分离 119

第四节 目的基因分离的策略 123

一、目的基因分离的策略 123

二、基因分离克隆策略的选择 123

第五节 基因功能的初步分析与鉴定 124

一、通过mRNA检测分析基因的表达谱 124

二、通过检测蛋白质分析基因的表达特征 125

三、通过功能获得和（或）功能缺失分析基因功能 125

思考题 126

参考文献 126

第四章 基因表达载体的构建 128

第一节 基因的表达与调控 128

一、基因表达调控是生命活动的必需 128

二、原核生物的基因表达与调控 129

三、真核生物的基因表达调控 133

第二节 目的基因的表达与功能分析 137

一、目的基因功能与表达分析的策略 137

二、基因表达载体构建的基本原理 138

第三节 农杆菌Ti质粒转化载体的构建 146

一、根癌农杆菌研究的历史 146

二、Ti质粒的结构 147

三、T-DNA的结构与功能 152

四、基于Ti质粒的转化载体的系统演化 157

五、Ti质粒载体的构建策略 161

六、常用Ti质粒双元载体的构建 163

第四节 植物基因表达载体构建实例 171

一、植物基因表达载体构建和优化策略 171

二、基因表达载体构建的实例 176

三、选择标记基因和报告基因的特点与选择 181

第五节 植物病毒载体的构建 185

一、基于基因组操作的植物病毒表达载体 185

二、基于基因转录机制的病毒表达载体 186

三、VIGS载体的构建及应用 187

四、植物病毒载体的应用 190

第六节 基因沉默技术原理 190

一、RNA干扰技术原理和应用 191

二、基因定点敲除技术 192

思考题 197

参考文献 197

第五章 作物的遗传转化与转化体筛选 199

第一节 作物基因转化受体系统 199

一、作物基因转化受体系统的条件 199

二、作物基因转化受体系统的类型及其特性 201

三、作物基因转化受体系统建立的程序 203

四、作物基因转化受体系统建立中的常见问题 205

第二节 农杆菌介导的遗传转化 207

一、农杆菌的生物学特性 208

二、常用根癌农杆菌及其特性 208

三、根癌农杆菌介导的转化程序 209

四、影响根癌农杆菌T-DNA转移的因素 209

五、根癌农杆菌介导的遗传转化技术 213

六、根癌农杆菌转化系统评价 219

第三节 基因枪介导的遗传转化 219

一、基因枪法的原理及其优缺点 219

二、基因枪转化小麦未成熟胚的技术流程 220

三、注意事项 222

第四节 花粉管通道介导的遗传转化 222

一、花粉管通道法的技术原理 223

二、花粉管通道法的操作程序 223

三、花粉管通道法的应用 224

第五节 其他常用遗传转化方法 225

一、显微注射法 225

二、聚乙二醇（PEG）介导法 227

三、电穿孔法 229

四、病毒介导的遗传转化 230

参考文献 232

第六章 转基因植株的鉴定及利用 234

第一节 转基因植株鉴定的策略 234

一、转基因植株鉴定的证据 234

二、外源基因的检测与鉴定策略 234

三、转基因植株鉴定的步骤 235

第二节 选择标记基因与报告基因的检测 235

一、抗抗生素类 236

二、抗除草剂类 237

三、报告基因类 238

第三节 目的基因的检测与分析 240

一、分子杂交 240

二、转基因植物的PCR-Southern blotting检测 242

三、外源基因表达水平的RT-PCR检测 243

四、外源基因拷贝数的检测 244

五、外源基因检测的衍生方法 246

第四节 目的基因的整合及效应 247

一、转基因植物中外源DNA的整合特性 247

二、转基因植物中外源DNA整合的遗传效应 251

三、提高外源基因表达效率的策略 252

第五节 目的基因的遗传特性 254

一、转基因的遗传传递规律 254

二、转基因的遗传稳定性 259

三、外界环境对转基因遗传特性的影响 261

第六节 作物转基因材料在育种中的应用 261

一、回交育种 261

二、转基因材料回交育种的特点 266

三、转基因快速、定向育种技术（以小麦为例） 267

思考题 269

参考文献 270

第七章 作物基因工程的安全性评价 272

第一节 基因工程安全性的争论 272

一、问题的由来 272

二、初步对策——安全准则 273

第二节 转基因作物的安全评价 274

一、为什么要对转基因作物进行安全性评价？ 274

二、转基因作物安全性评价的主要内容 275

三、国内外转基因作物的安全性评价概况 280

第三节 转基因作物——恶魔还是救星 281

思考题 282

参考文献 282

附录 作物基因工程主要实验技术 284

一、植物基因组DNA提取 284

二、植物基因组DNA的纯度检测 285

三、基因的PCR扩增 287

四、质粒DNA的线性化与连接重组 288

五、重组DNA的遗传转化 290

六、质粒DNA的电泳检测 291

七、植物总RNA的提取 292

八、RNA的变性琼脂糖凝胶电泳 294

九、植物组织全蛋白的提取 295

十、植物可溶性蛋白含量的考马斯亮蓝染色法测定 296

十一、植物可溶性蛋白含量的紫外吸收法测定 298

十二、禾谷类作物种子醇溶蛋白的毛细管电泳 300

十三、禾谷类种子醇溶蛋白A-PAGE鉴定 301

十四、蛋白质的SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 303

十五、植物组织蛋白质的双向电泳 304

十六、小麦的SSR分子标记分析 308

十七、小麦BSMV-VIGS解析基因功能 310

十八、作物基因工程综合大实验 312

参考文献 319