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第1章　绪论 1

背景 1

目录 1

前言 1

环境的控制 4

组织培养的优点 4

专业技能 5

局限性 5

样品的特征和均一性 5

经济、规模和机械化 5

体内模型 5

不稳定性 6

细胞的起源 6

量的问题 6

去分化和选择 6

组织培养的类型 7

体外的主要差异 7

细胞黏附 10

培养细胞的环境 10

第2章　培养细胞的生物学 10

细胞黏附分子 11

细胞周期 12

细胞增殖 12

细胞骨架 12

细胞增殖的控制 13

细胞去分化 14

细胞分化的维持 14

细胞分化 14

能量代谢 17

细胞系的演化 18

培养的开始 18

细胞的衰老 19

连续细胞系的形成 20

培养细胞的起源 21

规划 23

第3章　设计与布局 23

建设与使用 26

无菌操作区 27

布局 27

温室 28

培养箱 28

洗涮 32

准备 32

操作台 32

储存 33

组织培养实验室的要求 36

第4章　设备 36

洁净台 37

必需设备 37

培养箱 38

除菌器 39

CO2培养箱 39

冰箱和冷冻箱 41

清洗 42

倒置显微镜 42

水的纯化 43

除菌和干燥 43

冷藏器 44

离心机 44

细胞计数器 45

辅助设备 45

天平 45

血细胞计数板 45

抽气泵 46

温度记录仪 47

解剖镜 47

pH计 47

电导仪 47

渗透压计 47

普通显微镜 47

液体操作 48

滚动架 48

磁力搅拌器 48

玻璃器皿清洗机 53

低温冷冻箱 53

其他常用设备 53

视频摄像机和显示器 54

消耗性物品 55

流式细胞仪 55

集落计数器 55

可控速率冷冻箱 55

离心淘洗机 55

无菌容器 56

培养器皿 56

吸管 56

除菌过滤 57

注射器和针头 57

无菌的维持 58

无菌技术的目标 58

第5章　无菌技术 58

工作面 59

安静的工作区域 59

创造无菌环境的各种因素 59

培养物 61

试剂和培养基 61

个人卫生 61

灼烧 62

加盖 62

灭菌操作 62

擦拭 62

移液 63

试剂瓶和培养瓶的操作 63

层流 64

倒出液体 64

方案5.1　在洁净台内进行无菌操作 66

标准方法 66

方案5.2　在敞开的工作台上进行操作 68

方案5.3　培养皿和培养板的操作 70

培养平皿和多孔培养板 70

培养箱 71

仪器和设备 71

训练 72

充入CO2气体 72

盒装培养物 72

危险性评估 74

第6章　安全性 74

安全规则 76

标准操作程序 76

设备 77

操作者 77

常规安全 77

玻璃器皿和锐利的物品 78

气体 79

化学毒性 79

火 80

液氮 80

生物危害性 81

高能源 81

放射性 81

摄入 81

标记的试剂 81

防范水平 82

人的活检材料 84

丢弃物处理 85

遗传操作 85

附着材料 86

细胞的附着和生长 86

第7章　培养器皿 86

附着物 86

细胞产量 87

培养器皿的选择 87

悬浮培养 89

制样和分析 90

通风 90

价格 91

不均匀生长 91

透性支持物 92

特殊系统 92

基质覆盖 93

表面处理 93

方案7.1　细胞外基质（ECM）的制备 94

三维基质 95

饲养层 95

非黏附性附着面 96

各种人工附着面 96

液-胶或液-液界面 97

pH 98

物理化学特征 98

第8章　培养基 98

培养基的发展史 98

CO2和碳酸盐 99

方案8.1　pH标准色阶的制备 99

氧气 101

缓冲作用 101

温度 102

渗透压 102

表面张力和成泡性 103

黏滞度 103

完全培养基 104

平衡盐溶液 104

氨基酸 105

有机补充物 106

葡萄糖 106

维生素 106

盐类 106

血清 112

抗生素 112

激素和生长因子 112

生长因子 113

蛋白质 113

矿物质 115

脂类 115

激素 115

营养物及代谢物 115

培养基和血清的选择 116

抑制物 116

血清的测试 118

批次预约 118

胚胎浸出液 119

其他添加物 119

热灭活 119

适应性培养基 120

使用含血清的培养液的缺点 121

第9章　无血清培养液 121

无血清培养液的优点 122

血清的替代 123

无血清培养液的缺点 123

具有选择性 123

调节细胞增殖、分化 123

生长因子 124

激素 124

传代培养 124

无血清培养液的选择 138

基质 138

血清中的营养物质 138

蛋白质和多聚胺 138

血清替代物 139

无血清培养液的商业供应 139

小结 142

无血清培养基的制备 142

无血清培养液的研发 142

玻璃器皿 144

设备 144

第10章　准备与灭菌 144

方案10.1　玻璃器皿的准备和灭菌 147

方案10.2　移液管的准备和灭菌 150

移液管 150

螺口盖 151

方案10.3　螺口盖的准备和灭菌 153

种类繁杂的设备 154

清洁剂的选择 154

方案10.4　过滤装置的灭菌 155

可重复使用的灭菌过滤器 155

试剂和培养基 156

水 157

平衡盐溶液 158

培养基 159

方案10.5　BSS的制备 159

方案10.6　用1×储存液制备培养基 160

方案10.7　用10×浓缩液配制培养基 161

方案10.8　以干粉配制培养基 164

干粉培养基 164

特制培养基 165

方案10.9　特制培养基的准备 166

除菌过滤 168

灭菌 168

方案10.11　使用过滤瓶的灭菌过滤 171

方案10.10　用注射器式过滤器进行灭菌过滤 171

方案10.12　使用小型直线式过滤器的灭菌过滤 172

血清 173

方案10.13　使用大型直线式过滤器进行灭菌过滤 173

方案10.14 血清的收集与灭菌 174

方案10.15　血清的透析 176

无菌检测 177

质量控制 177

其他试剂的准备与灭菌 177

培养基的质控、检测和储存 177

培养检测 178

保存 179

组织分离 180

原代培养的类型 180

第11章　原代培养 180

方案11.1　分离小鼠胚胎 182

小鼠胚胎细胞培养 182

方案11.2　分离鸡胚 183

鸡胚细胞培养 183

人体活检材料 186

原代外植 188

原代培养 188

方案11.3　人体活检组织 188

方案11.4　原代外植 189

酶的解离作用 191

方案11.5　胰酶的温消化 192

方案11.6　胰酶的冷消化 195

低温预处理的胰酶消化 195

方案11.7　鸡胚器官原基 196

鸡胚器官原基 196

其他酶解过程 200

方案11.8　用胶原酶消化 201

胶原酶 201

方案11.9　利用筛网的机械分离法 203

机械消化 203

方案11.10　富集存活细胞 205

分离活细胞 205

原始记录 207

原代培养小结 207

传代培养和扩增 208

命名 208

第12章　细胞系 208

细胞系的命名 212

细胞系的永生化 212

细胞系的选择 213

细胞形态学 214

常规培养 214

方案12.1　更换培养基 215

体积、深度和表面积 215

培养基的更换 215

传代 216

维持培养基 216

传代标准 217

方案12.2　传代 218

传代比率和生长周期 220

悬浮培养细胞的增殖 222

传代时的细胞浓度 222

方案12.3　悬浮细胞传代 224

悬浮培养物的传代 224

培养记录 225

抗生素的使用 225

克隆培养 228

第13章　克隆培养及筛选 228

方案13.1　稀释法克隆培养 229

贴瓶率的激活 231

促进克隆生长的方法 232

饲养层细胞 233

方案13.2　条件培养基的制备 233

条件培养基 233

方案13.3　饲养层的准备 234

方案13.4　琼脂中克隆培养 235

悬浮克隆培养 235

方案13.5　美希索中克隆培养 238

方案13.6　用克隆环分离细胞克隆 240

克隆的分离 240

方案13.7　辐射法分离细胞集落 242

方案13.8　悬浮细胞克隆的分离 243

悬浮细胞克隆 243

单层贴壁细胞克隆的其他分离技术 243

选择性抑制剂 244

复制性培养 244

方案13.9甲氨蝶呤抗性和DHFR扩增 246

遗传变异细胞的筛选 246

选择性黏附 247

细胞与基质的相互作用 247

基质的性质 248

选择性解离 248

半固体培养基 251

选择性饲养层 251

方案14.1　密度梯度细胞分离法 253

细胞密度及等密度沉降法 253

第14章　细胞分离 253

免疫盘化法 257

免疫磁珠分离法 257

基于抗体的分离技术 257

方案14.2　磁性激活的细胞分选法（MACS） 260

离心淘洗分离技术 261

细胞体积与沉降速度 261

荧光激活的细胞分选法 262

其他分离技术 265

初试细胞分离者的选择 266

鉴定的需要 268

第15章　细胞鉴定 268

谱系或组织标记 269

种属鉴定 269

独特的标记 270

形态学 271

转化 271

方案15.1　倒置显微镜的使用 273

显微镜使用 273

方案15.2　GIEMSA染色 274

染色 274

方案15.3　结晶紫染色 275

细胞学检查所用培养器皿 276

方案15.4　涂片制备 277

悬浮细胞细胞学检查标本的制备 277

方案15.5　细胞离心机 278

方案15.6　过滤细胞学 279

方案15.7　利用胶片进行显微照相 280

照相技术 280

方案15.8　显微镜电子成像 282

电子影像记录 282

方案15.9　染色体制备 283

染色体分析 283

染色体显带技术 285

变异 286

染色体分析 286

DNA指纹技术 288

DNA杂交 288

染色体染色 288

DNA含量 288

方案15.10　细胞系的多位点DNA指纹检测 289

原理 289

同工酶 295

酶活性 295

RNA和蛋白质 295

方案15.11　同工酶分析 296

原理 296

抗原标记 299

多样性 299

分析 299

方案15.12　间接免疫荧光 301

证明 302

分化 302

其他方法 302

去分化 304

表现型的体内表达 304

第16章　分化 304

增殖和分化 305

定向和分化的各个阶段 305

定向和细胞谱系 306

分化标记物 307

可溶性诱导剂 308

诱导分化 308

旁分泌生长因子 311

细胞的相互作用 311

细胞-基质相互作用 312

负向作用的旁分泌因子 312

极性和细胞形状 313

应用方面 314

分化和恶性 314

细胞系特性的作用 316

第17章　转化 316

什么是转化？ 317

遗传不稳定性 318

永生性 319

DNA含量 319

染色体畸变 319

病毒基因的永生性 320

衰老的控制 320

方案17.1 成纤维细胞的永生性 321

人类成纤维细胞的永生性 321

转染后的培养物培养 324

停泊非依赖性 325

生长控制的异常 325

端粒酶诱导的永生性 325

转基因小鼠 325

接触抑制 326

方案17.2　细胞增殖的密度限制 328

血清依赖性 329

恶性肿瘤 330

肿瘤发生 330

侵袭性 331

致瘤作用 331

血管形成 332

纤溶酶原激活剂 333

污染源 334

第18章　污染 334

操作人员的技术 336

潮湿培养箱 337

使用和维护洁净台的层流 337

环境 337

无菌材料 338

冷冻储藏 338

方案18.1　清洁培养箱 338

污染的检测 339

微生物污染的种类 339

引入的细胞系和活检 339

检疫 339

支原体 340

可见的微生物污染 340

原则 342

方案18.2　荧光检测支原体 343

方案18.3　消灭微生物的污染 345

细菌、真菌和酵母 345

病毒污染 345

污染的去除 345

持久的污染 346

病毒污染的消除 346

支原体的消除 346

交叉污染 347

结论 348

细胞系的选择 349

保存 349

第19章　冷冻保存 349

冷冻保存的必要性 349

冷冻的理由 349

冷冻保存的阶段 350

培养条件的标准化 350

方案19.1　冷冻细胞 353

冷冻冰箱 357

冷冻率 357

方案19.2　融化冷冻细胞 359

冷冻柜记录 359

运送细胞 361

细胞库 361

连续置换 361

活的培养 362

冷冻安瓿 362

方案20.1　用血细胞计数板进行细胞计数 363

血细胞计数板 363

第20章　定量 363

细胞计数 363

电子计数 366

方案20.2　电子细胞计数 367

细胞重量 369

单层培养的染色 369

细胞大小测定 369

蛋白质 370

方案20.3　用Hoechst 33258测定DNA 370

DNA含量 370

方案20.4　用Bradford方法测定蛋白质含量 371

样品的溶解性 371

方案20.5　DNA合成 372

DNA合成 372

合成率 372

方案20.6　蛋白质合成 373

蛋白质合成 373

酶检测和免疫检测标本的制备 374

重复取样问题 375

流式细胞术 375

细胞计数术 375

原位标记 375

细胞增殖 376

数据分析 376

数据的获得 376

生长周期 377

实验设计 377

方案20.7　生长曲线，单层 378

生长周期分析 380

方案20.8　生长曲线，悬浮培养 380

悬浮培养 380

生长周期的变化 382

方案20.9　贴壁效率 383

贴壁效率 383

自动集落计数 384

方案20.10　3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的标记指数 385

标记指数 385

方案20.11　生长分数的测定 387

生长分数 387

细胞迁移 388

细胞周期时间 388

有丝分裂指数 388

分裂指数 388

导言 389

第21章　细胞毒性 389

分析的性质 390

体外局限性 390

方案21.1　染料排斥法测定细胞生存力 391

生存力 391

存活 392

方案21.2染料摄取法测定细胞生存力 392

方案21.3　克隆形成试验 393

代谢测定 397

细胞增殖测定 397

方案21.4　基于MTT的细胞素性试验 398

微滴定试验 398

其他说明 401

药物的相互作用 403

微滴定与克隆的比较 403

背景 404

转化 404

抗癌药物筛选 404

前瞻性试验 404

方案21.5　姐妹染色单体交换 405

致癌性 408

其他说明 408

炎症反应 409

上皮细胞 410

第22章　特殊细胞的培养 410

表皮 411

方案22.1表皮角质形成细胞 412

其他方法 415

细胞特征 415

方案22.2　角膜上皮细胞 416

角膜 416

乳腺 418

方案22.3　乳腺上皮 419

方案22.4　子宫颈部上皮 420

子宫颈 420

方案22.5　结肠直肠上皮 424

胃肠道 424

方案22.6　大鼠肝细胞的分离 427

肝 427

方案22.7　胰腺上皮 429

胰 429

肾 431

方案22.8　肾上皮 432

气管和支气管上皮 433

方案22.9　气管和支气管上皮 434

前列腺 435

方案22.10　前列腺上皮 436

脂肪组织 438

结缔组织 438

间充质细胞 438

方案22.11　脂肪细胞的原代培养 439

肌 440

方案22.12　骨骼肌 441

增殖和分化指数 442

方案22.13　用藻酸盐微珠培养软骨细胞 443

软骨 443

其他说明和应用 443

方案22.14　成骨细胞 447

骨 447

内皮细胞 449

方案22.15　血管内皮细胞的培养 450

神经细胞 451

神经外胚层细胞 451

方案22.16　小脑颗粒细胞的培养 452

神经胶质细胞 453

方案22.17　嗅球成鞘细胞 455

方案22.18　黑素细胞的培养方法 458

黑素细胞 458

内分泌细胞 458

造血细胞 461

方案22.19　骨髓造血细胞的长期培养方法 462

骨髓的长期培养 462

方案22.20　造血细胞克隆形成的实验方法 464

造血细胞集落形成实验 464

胚层细胞 467

生殖腺 467

第23章　肿瘤细胞培养 468

取材 469

原代培养 470

分离 470

细胞系的建立 471

肿瘤细胞的特征 471

选择性培养基 472

选择培养 472

连续细胞系 472

方案23.1　在汇合的饲养层上培养 473

汇合的饲养层 473

组织型培养 475

悬浮克隆 475

方案23.2　冻存活检标本 476

冷冻组织保存 476

异种移植 476

结肠 477

肺 477

特殊肿瘤类型 477

乳腺 477

皮肤 478

前列腺 478

胰腺 478

卵巢 478

精原细胞瘤 479

神经母细胞瘤 479

子宫颈 479

模型的选择 480

相互作用 480

第24章　器官型培养 480

细胞的相互作用和表型表达 480

气体和营养物质的交换 481

器官培养 481

器官培养的局限性 482

生长与分化 482

结构的完整性 482

方案24.1　器官培养 483

器官培养的类型 483

中空纤维 485

凝胶和海绵技术 485

组织型培养 485

方案24.2　球体培养 486

球体 486

藻酸盐活细胞固定术 488

方案24.3　藻酸盐包围 489

滤孔嵌套 490

方案24.4　滤孔嵌套 491

方案24.5　神经聚集物 493

神经聚集物培养 493

悬浮规模培养 496

第25章　规模培养 496

方案25.1　搅拌4L分批式悬浮培养 497

连续培养 499

搅匀和换气 500

规模和复杂性 500

方案25.2　Nunc细胞工厂 503

多表面增殖 503

单层规模培养 503

旋转培养 505

多列阵培养皿、螺旋柱和培养管 505

方案25.3　旋转瓶培养 506

微载体 508

方案25.4　微载体 509

灌流式单层培养 510

细胞生长的监控 511

第26章　特殊技术 514

淋巴细胞的分离 514

方案26.1　淋巴细胞的分离 514

原始细胞的转化 515

方案26.2　用PHA刺激淋巴细胞 515

放射自显影术 516

方案26.3　显微放射自显影术 517

间隔性记录 522

方案26.4　间隔性摄像 523

共聚焦显微镜 525

细胞同步化 525

细胞分离 525

阻断 525

羊膜细胞培养 526

方案26.5　羊膜细胞的培养 526

冷血动物细胞的培养 533

鱼细胞 533

方案26.6～26.8　所用试剂和培养基 534

方案26.6　从斑马鱼胚获得成纤维细胞饲养层 535

方案26.7　斑马鱼胚细胞的原代培养 536

方案26.8　建立斑马鱼胚细胞系 537

方案26.9　昆虫细胞的扩增 538

采用原位杂交技术对RNA基因表达的分析 540

原位分子杂交 540

方案27.1　原位杂交中的放射自显影技术 540

细胞培养的分子生物学 540

第27章　分子技术 540

荧光原位杂交技术在基因及染色体分析中的应用 546

方案27.2　利用单拷贝基因组探针及染色体刷漆进行荧光原位杂交 546

体细胞融合 549

方案27.3　细胞杂交 551

杂交克隆的筛选 552

单染色体移植 553

单克隆抗体的制备 553

移核实验 553

方案27.4　单克隆抗体的制备 554

转基因 559

磷酸钙共沉淀 560

方案27.5　磷酸钙介导DNA稳定转染 560

脂质体介导的转染 562

方案27.6　脂质体介导的瞬时转染 562

电穿孔法 564

方案27.7　电穿孔法稳定转染 564

其他DNA转移方法 566

报告基因 567

方案27.8　β-半乳糖苷酶的原位染色 567

方案27.9　氯霉素乙酰基转移酶（CAT）测定 568

第28章　问题与对策 570

细胞生长缓慢 570

实验室是否发生其他变化？ 571

是否培养基出现问题？ 572

某些不稳定的试剂 573

选择正确的培养基至关重要 573

谷氨酰胺 573

培养基的选择 573

纯水器工作是否正常？ 574

配制培养基各种成分的纯度 574

化学污染或玻璃蒸馏水器上是否有残留物？ 574

塑料管中是否有化学残留物？ 574

胰蛋白酶 574

其他成分 574

血清 574

塑料制品 575

血清 575

玻璃器皿 575

微生物污染 575

抗菌素 575

碳酸氢钠 575

针对单一使用者 576

针对多人共有的问题 577

污染物的鉴定 578

来自玻璃器皿的污染 579

吸液管 579

化学污染 579

原代培养 580

粉末或气溶胶 580

原代培养常见的问题 580

其他试剂 580

水的纯度 580

细胞选择有误 581

污染 581

如果克隆太弥散 582

如果出现细胞贴壁效率降低 582

如果每个培养皿中克隆数目过多 582

克隆 582

如果丧失产物形成能力 583

如果细胞不发生分化 583

饲养层 583

常规单层培养 583

分化 583

如果细胞呈现不贴壁现象 583

如果培养细胞出现非随机分布 583

培养基 584

老化 584

生长不均匀 584

交叉污染 584

传代培养的细胞周期 584

传代 584

克隆培养 584

冻存 585

“治疗” 585

如果复苏时活率不高 585

“预防” 585

“体征” 585

细胞成颗粒性 586

存货用磬 586

细胞内出现颗粒 586

污染 586

冻存后细胞形态发生变化 586

使用血球计数板 587

细胞计数 587

电子计数仪 587

细胞外出现颗粒 587

成活率检测 588

形态学观察 588

细胞毒性检测 588

成活率 588

结语 589

附录：试剂及配制 590

商业索引 600

材料来源 600

供应商和其他资源 605

参考文献 633

推荐参考书目 671

相关杂志 672

索引 673

词汇表 697

图版Ⅰ～Ⅻ 704