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第1章 概述 1

1.1 基因工程的基本概念 1

1.2 基因工程的发展历史 5

1.3 基因工程的研究意义 7

第2章 基因表达调控的原理与技术 10

2.1 启动子调控模型 10

2.1.1 启动子的组成及其功能 10

2.1.2 启动子的顺式增强作用 14

2.1.3 启动子的反式协同作用 16

2.1.4 启动子结构的多样性 19

2.2 操纵子调控模型 22

2.2.1 操纵子基因表达调控的基本原理 22

2.2.2 乳糖操纵子 24

2.2.3 半乳糖操纵子 28

2.2.4 阿拉伯糖操纵子 29

2.2.5 色氨酸操纵子 30

2.2.6 λ噬菌体的操纵子 31

2.3 感受应答调控模型 34

2.3.1 感受应答调控模型的基本原理 34

2.3.2 真核生物转录调控元件的相互作用 37

2.3.3 真核生物转录调控因子的激活方式 39

2.4 RNA结构调控模型 40

2.4.1 终止子的工作原理 40

2.4.2 衰减子的工作原理 42

2.4.3 反义子的工作原理 44

2.5 RNA剪切编辑调控模型 46

2.6 基因工程的支撑技术 47

2.6.1 核酸凝胶电泳技术 47

2.6.2 核酸分子杂交技术 49

2.6.3 细菌转化转染技术 55

2.6.4 聚合酶链反应技术 59

2.6.5 DNA序列分析技术 64

2.6.6 寡核苷酸合成技术 67

2.6.7 基因定点突变技术 70

第3章 基因工程的单元操作 74

3.1 工具酶 74

3.1.1 限制性核酸内切酶 74

3.1.2 T4 DNA连接酶 79

3.1.3 DNA聚合酶 79

3.1.4 核酸酶 82

3.1.5 核酸修饰酶 83

3.2 载体 84

3.2.1 质粒载体 85

3.2.2 λ双链噬菌体DNA载体 90

3.2.3 M13单链噬菌体DNA载体 95

3.2.4 噬菌体／质粒杂合载体 97

3.2.5 人造染色体载体 99

3.3 受体细胞 99

3.4 DNA的体外重组（切与接） 101

3.4.1 DNA切接反应的影响因素 102

3.4.2 DNA分子重组的方法 105

3.5 重组DNA分子的转化与扩增（转与增） 112

3.5.1 转化率及其影响因素 112

3.5.2 转化细胞的扩增 114

3.6 转化子的筛选与重组子的鉴定（检） 114

3.6.1 基于载体遗传标记的筛选与鉴定 114

3.6.2 基于克隆片段序列的筛选与鉴定 117

3.6.3 基于外源基因表达产物的筛选与鉴定 123

3.7 目的基因的克隆 126

3.7.1 鸟枪法 126

3.7.2 cDNA法 129

3.7.3 PCR扩增法 137

3.7.4 化学合成法 141

3.7.5 基因文库的构建 142

第4章 大肠杆菌的基因工程 147

4.1 外源基因在大肠杆菌中的高效表达原理 147

4.1.1 启动子 147

4.1.2 终止子 152

4.1.3 SD序列 153

4.1.4 密码子 154

4.1.5 质粒拷贝数 155

4.2 大肠杆菌工程菌的构建策略 157

4.2.1 包涵体型异源蛋白的表达 157

4.2.2 分泌型异源蛋白的表达 161

4.2.3 融合型异源蛋白的表达 164

4.2.4 寡聚型异源蛋白的表达 168

4.2.5 整合型异源蛋白的表达 171

4.2.6 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 173

4.3 重组异源蛋白的体外复性活化 175

4.3.1 包涵体的溶解与变性 175

4.3.2 异源蛋白的复性与重折叠 177

4.4 大肠杆菌工程菌培养的最优化控制 182

4.4.1 细菌生长的动力学原理 182

4.4.2 发酵过程的最优化控制 184

4.4.3 大肠杆菌工程菌的高密度发酵 187

4.5 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 189

4.5.1 工程菌遗传不稳定性的表现与机制 189

4.5.2 改善工程菌不稳定性的对策 190

4.6 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素 193

4.6.1 胰岛素的结构及其生物合成 193

4.6.2 人胰岛素的生产方法 194

4.6.3 产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略 195

第5章 酵母的基因工程 198

5.1 酵母的受体系统 198

5.1.1 提高重组异源蛋白产率的突变型受体 198

5.1.2 抑制超糖基化作用的突变型受体 199

5.1.3 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变型受体 200

5.1.4 内源性蛋白酶缺陷型的突变型受体 201

5.2 酵母的载体系统 202

5.2.1 酿酒酵母中的2μ环状质粒 202

5.2.2 乳酸克鲁维酵母中的线状质粒 203

5.2.3 果蝇克鲁维酵母中的环状质粒 203

5.2.4 含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建 204

5.2.5 含有CEN的YCp载体及其构建 205

5.2.6 含有TEL的YAC载体及其构建 205

5.3 酵母的转化系统 207

5.3.1 酵母的转化程序 207

5.3.2 转化质粒在宿主细胞中的命运 208

5.3.3 用于转化子筛选的标记基因 209

5.4 酵母的表达系统 211

5.4.1 酵母启动子的基本特征与选择 211

5.4.2 酵母启动子的可调控表达系统 212

5.4.3 外源基因在酵母中表达的限制性因素 214

5.4.4 酵母表达系统的选择 215

5.5 酵母的蛋白修饰分泌系统 219

5.5.1 酵母的蛋白质分泌运输机制 219

5.5.2 酵母的信号肽及其剪切系统 220

5.5.3 酵母分泌型蛋白的糖基化修饰 221

5.6 利用重组酵母生产乙肝疫苗 224

5.6.1 乙肝病毒的结构 224

5.6.2 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母构建 225

5.6.3 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母构建 225

5.7 利用重组酵母生产人血清清蛋白 226