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目录 1

第一章　显微技术 1

第一节 显微观察 1

一、相差显微镜 1

【实验1-1】相差显微镜的使用 2

二、荧光显微镜 5

【实验1-2】荧光显微镜的使用 8

三、电子显微镜 8

【实验1-3】细菌、酵母菌超薄切片的透射电镜观察 12

【实验1-4】噬菌体的透射电镜观察 14

【实验1-5】质粒DNA的透射电镜观察 15

【实验1-6】酵母细胞的扫描电镜观察 18

第二节 显微摄影 20

【实验1-7】显微摄影、菌落摄影和凝胶摄影 21

第三节 放射自显影 25

【实验1-8】硝酸纤维素滤纸上标记DNA的放射自显影 25

第四节 显微操作技术用于单细胞分离 27

【实验1-9】显微操纵仪用于单细胞分离 29

【实验1-10】显微操纵仪用于酵母子囊的解剖及子囊孢子单孢化 30

【实验1-11】玻璃微型工具的制作 31

第二章　微生物细胞特殊结构的观察 33

第一节 染色技术 33

一、染色的基本原理 33

二、染料 34

三、染色 36

【实验2-1】真菌的荧光染色与观察 36

第二节 细胞主要结构成分的分离与观察 38

【实验2-2】革兰阳性细菌细胞壁的制备 39

【实验2-3】酵母细胞壁甘露聚糖的制备 41

【实验2-4】细胞壁的形态观察 42

【实验2-5】革兰阴性菌细胞外膜蛋白的分离 43

【实验2-6】细菌荚膜的观察 44

【实验2-7】细菌鞭毛的观察 45

【实验2-8】微生物细胞核的观察 47

【实验2-9】细菌染色体DNA的分离与观察 49

【实验2-10】异染颗粒的观察 51

【实验2-11】酵母细胞内脂肪颗粒和肝糖颗粒的观察 52

【实验2-12】酵母液泡及线粒体的提取 54

一、芽孢 57

第三节 芽孢、子囊孢子和假菌丝的观察 57

【实验2-13】细菌芽孢形成及发芽的观察 59

【实验2-14】伴孢晶体的观察 60

二、酵母子囊孢子 61

【实验2-15】酵母子囊孢子的形成及观察 63

【实验2-16】酵母单倍体的分离与鉴定 64

三、酵母假菌丝 66

【实验2-17】酵母假菌丝的观察 66

第三章　噬菌体 69

【实验3-1】噬菌体的分离与纯化 72

【实验3-2】高效价噬菌体原液的制备 74

【实验3-3】溶源菌的鉴定 75

【实验3-4】抗噬菌体产α-淀粉酶菌株的选育 77

第四章　标记菌种的获得与应用 79

第一节 富集培养技术在获得标记菌种中的应用 79

一、营养缺陷型富集法在原核细胞中的应用 79

二、营养缺陷型富集法在真核细胞中的应用 81

三、浓度梯度法富集抗性突变株 82

四、富集法在研究次级代谢的重组DNA技术中的应用 84

第二节 营养缺陷型标记菌种的获得 84

三、检出缺陷型 85

一、诱变方法 85

二、淘汰野生型 85

四、营养缺陷型生长谱的确定 87

【实验4-1】芽孢杆菌营养缺陷型的筛选 89

【实验4-2】酵母营养缺陷型的筛选 91

【实验4-3】青霉菌营养缺陷型菌株的筛选 92

第三节 呼吸缺陷型标记菌种的获得 94

【实验4-4】酵母呼吸缺陷型的筛选 94

第四节 抗反馈调节抗性突变株的获得与应用 95

【实验4-5】氨基酸抗反馈调节突变株的选育 98

第一节 工业菌种育种的策略 101

第五章　原生质体系列育种技术 101

第二节 原生质体融合育种 102

一、原生质体融合育种的特点 103

二、原生质体融合育种步骤与要点 107

三、原生质体再生率和融合率的计算 115

【实验5-1】芽孢杆菌的原生质体融合 115

【实验5-2】链霉菌原生质体融合 119

【实验5-3】小单胞菌的原生质体融合 124

【实验5-4】酿酒酵母的原生质体融合 125

【实验5-5】丝状真菌的原生质体融合 128

第三节 原生质体转化育种 134

【实验5-6】芽孢杆菌原生质体转化 134

【实验5-7】质粒DNA转化链霉菌原生质体 137

【实验5-8】酿酒酵母的原生质体转化法 138

【实验5-9】真菌原生质体转化 139

第四节 原生质体诱变育种 141

【实验5-10】芽孢杆菌种间融合子F-26-2原生质体诱变育种 142

【实验5-11】紫外线诱变原生质体选育L-谷氨酸高产菌 143

一、紫外线照射原生质体增加融合率 145

第五节 原生质体技术中的一些特殊技术 145

二、供体原生质体的热灭活 146

三、原生质体电融合技术 147

【实验5-12】电诱导酵母原生质体融合 147

四、遗传转移 148

【实验5-13】原生质体融合法转移酵母线粒体及杀伤质粒 148

第六章　基因工程育种技术 151

第一节 基因工程的基本过程和原理 151

一、载体 152

二、DNA重组用酶 154

三、宿主细胞 155

四、外源DNA 156

第二节 大肠杆菌基因工程 160

一、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 160

【实验6-1】用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌（Ⅰ） 161

【实验6-2】用氯化钙制备感受态大肠杆菌（Ⅱ） 162

【实验6-3】用PEG制备和转化大肠杆菌感受态细胞 163

【实验6-4】大肠杆菌的电击转化 164

二、大肠杆菌中质粒的提取与纯化 166

【实验6-5】质粒的大量提取与纯化 166

【实验6-6】质粒的小量提取 168

【实验6-7】用硅胶膜分离法小量提取质粒 169

三、微生物染色体DNA的提取与PCR扩增 170

【实验6-8】枯草杆菌染色体DNA的提取 170

【实验6-9】真菌染色体DNA的简易提取方法 171

【实验6-10】枯草杆菌淀粉酶基因的PCR扩增 173

【实验6-11】从电泳凝胶中分离枯草杆菌淀粉酶基因 174

四、外源基因在大肠杆菌中的高表达 175

【实验6-12】载体和基因的酶切 180

【实验6-13】基因与载体的连接 180

第三节 非大肠杆菌微生物基因工程 184

一、芽孢杆菌基因工程 185

【实验6-14】枯草杆菌感受态细胞的制备和转化 186

【实验6-15】地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化 187

【实验6-16】枯草杆菌转化子质粒的提取和检测 188

【实验6-17】高碱性蛋白酶基因多拷贝重组菌的构建 190

二、酵母基因工程 194

【实验6-18】酵母染色体DNA的提取 196

【实验6-19】酿酒酵母的乙酸锂完整细胞转化法 197

【实验6-20】单链载体DNA的制备 198

【实验6-21】酵母菌质粒DNA的提取 199

【实验6-22】巴斯德毕赤酵母的电转化方法 200

【实验6-23】羟酸还原异构酶基因多拷贝重组啤酒酵母的构建 201

第七章　微生物细胞固定化方法 205

第一节 载体结合法 206

一、表面吸附法 206

二、共价结合法 207

第二节 交联法 208

第三节 包埋法 208

一、海藻酸钙凝胶包埋法 209

【实验7-1】酿酒酵母的海藻酸钙固定化 211

【实验7-2】固定化枯草杆菌连续生产耐热α-淀粉酶 213

二、κ-角叉胶包埋法 215

【实验7-3】κ-角叉胶一步包埋法 215

【实验7-4】κ-角叉胶二步包埋法 217

【实验7-5】固定化酵母连续生产酒精 218

【实验7-6】固定化细胞的回收与活细胞计数 219

三、聚丙烯酰胺凝胶包埋法 219

【实验7-7】大肠杆菌的聚丙烯酰胺凝胶固定化 220

四、光交联树脂前聚体包埋法 221

【实验7-8】光交联树脂固定化原生质体 221

五、其他载体包埋方法 222

第四节 几种固定化细胞方法联用 224

一、包埋-交联法 224

二、吸附-交联法 225

三、包埋-吸附法 225

第五节 其他固定化方法 225

第六节 固定化微生物细胞方法的选择 226

一、固定化微生物细胞方法的选择 226

二、固定化细胞技术的评价指标 227

第七节 微生物细胞固定化技术前景展望 227

主要参考文献 229