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实验一 毒理学实验的基础知识与综合技能 1

一、案例与问题 1

二、毒理学实验概述 1

三、毒理学实验规范与职业道德 3

四、毒理学实验设计要求 4

五、实验动物管理与实验者自身防护 6

六、动物实验流程与基本操作技术 7

七、思考题 13

实验二 毒物代谢动力学研究与实验技术 14

一、教学目的与意义 14

二、背景资料 14

三、案例与问题 14

四、课题设计与实验指导 15

课题名称：对硫磷与甲基对硫磷代谢动力学实验 15

五、毒物代谢动力学试验主要方法与技术 21

【题目】甲基对硫磷的代谢转化试验 21

六、思考题 24

实验三 一般毒性研究与实验技术 25

一、教学目的与意义 25

二、背景资料 25

三、案例与问题 26

四、课题设计与实验指导 26

课题名称：氯胺嘧草醚的一般毒性试验与评价 26

五、一般毒性试验主要方法与技术 28

（一）急性经口毒性试验 28

（二）急性吸入毒性试验 33

（三）急性经皮毒性试验 34

（四）亚慢性毒性实验 35

（五）慢性毒性试验 38

六、思考题 40

实验四 遗传毒性研究与实验技术 41

一、教学目的与意义 41

二、背景资料 41

三、案例与问题 42

四、课题设计与实验指导 42

课题名称：苯并（a）芘的遗传毒性测试与评价 42

五、遗传毒性试验主要方法与技术 43

（一）鼠伤寒沙门菌营养缺陷型回复突变试验 43

（二）哺乳动物细胞基因突变试验 47

实验1 小鼠淋巴瘤细胞L5178YTK+/-基因突变试验 48

实验2 中国仓鼠肺V79(CHO)/hGPRT基因突变试验 49

（三）小鼠骨髓细胞微核试验 51

（四）染色体畸变分析 52

实验1 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 53

实验2 动物骨髓细胞染色体畸变试验 55

（五）单细胞凝胶电泳试验 56

六、思考题 58

实验五 表观遗传毒性研究与实验技术 59

一、教学目的与意义 59

二、背景资料 59

三、案例与问题 59

四、课题设计与实验指导 60

课题名称：某环境有害因素与表观遗传修饰改变的关联性研究 60

五、表观遗传毒性实验主要方法与技术 62

（一）DNA甲基化检测的主要方法和技术 62

实验1 亚硫酸氢盐修饰结合甲基化特异性PCR 62

实验2 亚硫酸氢盐修饰后测序 64

（二）组蛋白修饰检测的主要方法和技术 65

实验1 组蛋白特定位点修饰水平的检测——蛋白质印迹法 65

实验2 组蛋白特定位点在基因富集水平的检测——染色质免疫共沉淀法 67

（三）microRNA检测的主要方法和技术 69

实验1 实时荧光定量PCR法检测microRNA表达 69

实验2 双荧光素酶报告系统验证microRNA靶基因 71

六、思考题 72

实验六 致癌作用研究与实验技术 73

一、教学目的与意义 73

二、背景资料 73

三、案例与问题 74

四、课题设计与实验指导 74

课题名称：NNK致癌作用测试及评价 74

五、致癌作用实验主要方法与技术 76

（一）细胞体外恶性转化实验 76

（二）哺乳动物长期致癌实验 81

（三）其他致癌实验 84

六、思考题 85

实验七 生殖发育毒性研究与实验技术 86

一、教学目的与意义 86

二、背景资料 86

三、案例与问题 86

四、课题设计与实验指导 87

课题名称：镉及其化合物的生殖发育毒性评价 87

五、生殖发育毒性试验主要方法与技术 89

（一）生育力和早期胚体发育毒性试验 89

（二）致畸试验 90

（三）围生期发育毒性试验 93

（四）一代（或二代）生殖毒性试验 94

（五）精子质量分析 96

（六）性激素水平的测定 97

（七）外源化学物对大鼠睾丸间质细胞的损伤模型 98

（八）外源化学物对大鼠卵巢颗粒细胞的损伤模型 100

六、思考题 101

实验八 纳米材料损害作用研究与实验技术 102

一、教学目的与意义 102

二、背景资料 102

三、案例与问题 103

四、课题设计与实验指导 103

课题名称：纳米二氧化钛的毒性作用评价 103

五、纳米材料损害作用试验主要方法与技术 105

（一）纳米材料的前处理方法 105

（二）纳米材料表面特征观察 107

（三）纳米材料对细胞活力的影响 108

（四）纳米材料急性经口毒性实验 109

六、思考题 111

实验九 电离辐射损害作用研究与实验技术 112

一、教学目的与意义 112

二、背景资料 112

三、案例与问题 112

四、课题设计与实验指导 112

课题名称：电离辐射生物损伤效应特征及常用检测方法 112

五、电离辐射损害作用试验主要方法与技术 113

（一）核素溶液配制 113

（二）铀矿尘对细胞增殖的影响 115

（三）铀矿尘致支气管上皮细胞损伤的活性氧检测 116

（四）电离辐射致DNA双链损伤的γ-H2AX含量变化检测 117

六、思考题 119

实验十 呼吸系统毒性研究与实验技术 120

一、教学目的与意义 120

二、背景资料 120

三、案例与问题 121

四、课题设计与实验指导 121

课题名称：PM2.5急性肺毒性作用研究 121

五、呼吸系统毒性试验主要方法与技术 123

（一）潮气量和气流流速测定 123

（二）胸内压测定 124

（三）呼吸道液分泌功能测定——小鼠酚红排泄法 124

（四）支气管肺泡灌洗液（BALF）分析 125

（五）大鼠气道黏液中肺表面活性物质的测定 128

（六）离体试验法 128

实验1 离体肺灌流与分析 128

实验2 离体气管片试验法 129

实验3 乳鼠肺细胞原代培养与上皮细胞纯化 130

实验4 体外培养的肺巨噬细胞中乳酸脱氢酶（LDH）活性测定 131

六、思考题 133

实验十一 肝脏毒性研究与实验技术 134

一、教学目的与意义 134

二、背景资料 134

三、案例与问题 134

四、课题设计与实验指导 135

课题名称：评价未知化学物肝损害及探讨其毒性作用机制 135

五、肝脏毒性试验主要方法与技术 136

（一）肝损伤动物模型建立 136

实验1 急性化学性肝损伤动物模型 136

实验2 肝纤维化动物模型 137

（二）肝脏亚细胞组分的制备 138

实验1 肝脏微粒体的制备 138

实验2 肝脏线粒体的制备 139

（三）肝损害体内评价技术 139

实验1 肝微粒体细胞色素P450含量的测定 139

实验2 丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性测定 140

实验3 天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性测定 141

实验4 碱性磷酸酶（ALP）活性测定 142

实验5 肝脏排泄功能测定 143

实验6 肝脏分泌功能测定 144

实验7 肝纤维化测定 145

（四）肝损害体外评价方法 146

实验1 离体肝脏灌流与分析 146

实验2 肝细胞、Kupffer和Ito细胞的分离与培养 148

实验3 肝细胞膜流动性检测 150

实验4 肝细胞线粒体膜通透性检测 151

实验5 肝细胞线粒体膜电位检测 152

实验6 肝细胞线粒体呼吸功能检测 153

实验7 肝细胞线粒体能量代谢功能检测 155

六、思考题 156

实验十二 肾脏毒性研究与实验技术 157

一、教学目的与意义 157

二、背景资料 157

三、案例与问题 158

（一）案例一 158

（二）案例二 158

四、课题设计与实验指导 158

课题名称一：中药关木通引起大鼠肾脏毒性作用探讨 158

课题名称二：综合评价百草枯急性中毒引起的肾脏毒性作用 159

五、肾脏毒性试验主要方法与技术 160

（一）尿液的一般生化指标测定 160

（二）肾脏血流动力学和血流量分析 161

（三）肾小球滤过率测定 161

（四）血肌酐、尿素和尿酸浓度测定 162

（五）肾浓缩稀释试验 163

（六）形态学和酶组织化学检查 163

（七）肾脏微灌注及微穿刺技术 164

（八）肾皮质薄片培养及肾膜囊泡的分离与应用 165

六、思考题 166

实验十三 神经系统毒性研究与实验技术 167

一、教学目的与意义 167

二、背景资料 167

三、案例与问题 168

（一）案例一 168

（二）案例二 168

（三）案例三 168

四、课题设计与实验指导 168

课题名称一：评价MPTP对小鼠大脑多巴胺能神经元的损伤 168

课题名称二：综合评价有机磷化合物的迟发性神经毒性 169

课题名称三：正己烷神经毒性及机制探讨 170

五、神经系统毒性试验主要方法与技术 171

（一）实验动物神经行为学 171

实验1 自主活动度检测（旷场试验） 171

实验2 Morris水迷宫实验 172

实验3 转棒试验（滚轴试验） 173

实验4 后肢撑力实验 173

实验5 抓力测定 174

实验6 感觉神经功能 174

方法1．鼠尾痛觉测定 174

方法2．智能热板仪法 175

（二）神经病理形态学方法 175

实验1 神经细胞尼氏体染色 175

实验2 免疫组化检测MPTP诱导的小鼠大脑多巴胺能神经元损伤（SP法） 176

（三）周围神经传导速度测定 178

（四）HPLC荧光法测定动物大脑兴奋性神经递质 178

（五）大鼠海马组织突触膜谷氨酸受体的放射配体结合分析 179

（六）神经元体外试验体系 181

（七）有机磷农药的迟发性神经毒性评价 181

六、思考题 182

实验十四 免疫毒性研究与实验技术 183

一、教学目的与意义 183

二、背景资料 183

三、案例与问题 184

四、课题设计与实验指导 184

课题名称：阿特拉津的免疫毒性检测与评价 184

五、免疫毒性试验主要方法与技术 185

（一）体液免疫检测 185

实验1 溶血空斑实验 185

实验2 血清中免疫球蛋白IgG和IgM的测定 187

（二）特异性细胞免疫反应 187

实验1 淋巴细胞增殖实验 187

实验2 迟发型过敏反应（delayed-type hypersensi-tivity,DTH） 188

实验3 细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）活性的测定 189

（三）非特异性细胞免疫反应 189

实验1 NK细胞活性检测（乳酸脱氢酶释放法） 189

实验2 巨噬细胞吞噬能力检测 190

六、思考题 191

实验十五 血液毒性研究与实验技术 192

一、教学目的与意义 192

二、背景资料 192

三、案例与问题 193

四、课题设计与实验指导 194

五、血液毒性试验主要方法与技术 195

（一）红细胞毒性检测 195

实验1 网织红细胞计数 195

实验2 红细胞渗透脆性试验 196

实验3 高铁血红蛋白测定 196

实验4 变性珠蛋白小体测定 197

实验5 碳氧血红蛋白测定 198

实验6 铁动力学试验 199

（二）白细胞和血小板毒性检测 199

实验1 白细胞墨汁吞噬试验 199

实验2 血小板黏附试验 200

（三）凝血功能毒性检测 201

实验1 血浆凝血酶原时间测定 201

实验2 活化部分凝血活酶时间测定 202

（四）骨髓毒性检测 203

实验1 骨髓细胞学检查 203

实验2 外源性脾结节测定 205

实验3 体内扩散盒琼脂培养技术 206

实验4 骨髓微循环观察 206

六、思考题 207

实验十六 皮肤毒性研究与实验技术 208

一、教学目的与意义 208

二、背景资料 208

三、案例与问题 209

四、课题设计与实验指导 210

课题名称：海娜粉皮肤毒理学安全性评价 210

五、皮肤毒性试验主要方法与技术 212

（一）皮肤刺激性／腐蚀性试验 212

（二）急性眼刺激性／腐蚀性试验 214

（三）皮肤变态反应试验 217

（四）小鼠耳肿胀试验（mouse ear swelling test,MEST） 219

（五）皮肤光毒性试验 220

（六）皮肤光变态反应试验 221

（七）人体斑贴试验 222

（八）人体皮肤试用试验 224

六、思考题 225

实验十七 毒理学替代法的应用与实验技术 226

一、教学目的与意义 226

二、背景资料 226

三、案例与问题 227

（一）案例 227

（二）问题 228

四、课题设计与试验指导 228

课题名称：用毒理学替代试验对化妆品原料——果酸的一般毒性和特殊毒性进行筛选和检测 228

五、毒理学替代试验主要方法与技术 228

（一）急性经口毒性替代试验——急性毒性分级法 228

（二）皮肤腐蚀性替代试验——人重组皮肤模型试验 232

（三）发育毒性替代试验——微团培养试验（the micromass test,MM Test） 234

六、思考题 239

实验十八 毒理学与公共卫生安全和管理实例分析 240

一、教学目的与意义 240

二、背景资料 240

三、案例分析 242

四、思考题 247

参考文献 248