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1.酶组织化学 1

1.1 酶组织化学的原理及一般原则 1

1.1.1 酶组织化学的基本原理 1

1.1.2 酶组织化学的一般原则 1

1.2 酶组织化学对组织处理的要求 1

1.3 酶显示方法 2

1.3.1 金属离子沉淀反应 2

1.3.2 偶氮盐偶联反应 2

1.3.3 靛蓝反应 3

1.3.4 四唑反应 3

1.4 酶组织化学的应用 3

1.4.1 了解组织细胞的代谢活动 3

1.4.2 细胞类型的判定 3

1.4.3 细胞定位 3

1.4.4 癌变过程的研究 3

1.4.5 免疫组化和杂交组化的显示手段 4

2.免疫组织化学 5

2.1 免疫组织化学中的免疫化学 5

2.1.1 抗原的提取和纯化 5

2.1.2 合成肽的选择及半抗原的处理 8

2.1.3 细菌超表达克隆化基因作为抗原的常用方法及原则 9

2.1.4 抗体的制备 9

2.1.5 抗体的标记 12

2.2 组织细胞的处理 13

2.2.1 组织细胞处理的重要性 13

2.2.2 取材 14

2.2.3 固定 14

2.2.4 脱水 16

2.2.5 包埋 17

2.2.6 切片 17

2.2.7 染色 18

2.2.8 切片封固和保存 18

2.3 石蜡组织切片中抗原性的修复 18

2.3.1 蛋白酶消化修复 18

2.3.2 热修复 19

2.3.3 微波照射与蛋白酶消化联合应用 20

2.4 免疫组织化学染色原理和方法 21

2.4.1 免疫荧光法 22

2.4.2 免疫酶法 23

2.4.3 亲合免疫组化 24

2.4.4 其他方法 26

2.4.5 免疫组化染色阳性信号的原位放大 27

2.5 非特异着色及对照的设置 27

2.5.1 非特异着色及其消除方法 27

2.5.2 对照设置 29

2.5.3 增强对比度，提高染色效果 30

2.6 双重或多重免疫组化 30

2.6.1 常用的双标或多标记法 30

2.6.2 消除双重染色间交叉反应的方法 32

2.6.3 双标或多标记染色的注意事项 32

2.7 免疫电子显微镜技术 33

2.7.1 标记物 33

2.7.2 包埋前法 34

2.7.3 包埋后法 36

2.7.4 不包埋法 37

2.7.5 双标记或多标记法 37

3.杂交组织化学 39

3.1 杂交组织化学的原理 39

3.2 探针类型、制备及标记 40

3.2.1 探针的类型和制备 40

3.2.2 探针的标记 41

3.3 组织和细胞标本的制备 46

3.4 原位杂交技术 47

3.4.1 杂交前处理 47

3.4.2 杂交 48

3.4.3 杂交后处理 49

3.4.4 对照 49

3.5 原位PCR技术 50

3.5.1 直接原位PCR 50

3.5.2 间接原位PCR 50

3.5.3 原位反转录PCR 51

3.5.4 原位端粒重复序列扩增法 51

3.6 杂交组织化学的进展 51

3.6.1 双重或多重杂交组化技术 51

3.6.2 杂交-免疫组化联合检测 52

3.6.3 电镜下的杂交组化 52

3.6.4 原位标记杂交 52

4.现代组织化学定量技术 54

4.1 图像分析技术概述 54

4.2 图像处理和分析的基本原理 54

4.3 图像分析的基本方法 55

4.3.1 二维几何参数的测量 55

4.3.2 灰度参数和光密度测量(图像细胞光度技术) 56

4.3.3 其他 56

4.3.4 激光扫描共聚焦显微镜 56

4.4 图像分析和形态定量技术的应用前景 57

5.现代组织化学的应用 59

5.1 肿瘤诊断与鉴别诊断 59

5.1.1 上皮性肿瘤 59

5.1.2 淋巴瘤 61

5.1.3 软组织肿瘤 67

5.1.4 神经内分泌肿瘤 69

5.1.5 肿瘤中雌、孕、雄激素受体 70

5.1.6 肿瘤中癌基因和抗癌基因 72

5.1.7 肿瘤细胞增殖活性 75

5.2 免疫性疾病的诊断与研究 76

5.2.1 常用免疫组化试剂 77

5.2.2 免疫性损伤 78

5.2.3 变态反应性疾病 79

5.2.4 移植物排异反应 81

5.3 细胞外基质的研究 81

5.3.1 细胞外基质的成分 81

5.3.2 细胞外基质的生成和降解 84

5.3.3 细胞外基质的原位检测方法 86

5.3.4 细胞外基质原位检测的应用 88

5.4 病原生物体的检测 90

5.4.1 病毒核酸及表达产物的定位 90

5.4.2 细菌 99

5.4.3 寄生虫和真菌 100

5.5 细胞增殖、凋亡及其检测 101

5.5.1 细胞增殖的检测 101

5.5.2 细胞凋亡的表现及其调控 101

5.5.3 细胞凋亡的诱导和抑制 103

5.5.4 凋亡的检测 103

5.5.5 细胞凋亡的医学意义 106

6.现代组织化学的进展 110

6.1 现代组织化学与显微切割技术 110

6.1.1 显微切割技术的原理 110

6.1.2 显微切割的方法 110

6.1.3 显微切割后的细胞处理 112

6.1.4 显微切割的应用 112

6.2 组织芯片 115

6.3 冷冻细胞阵列 115

6.4 荧光及杂交组织化学新进展 115

6.4.1 绿色荧光蛋白及其突变体 116

6.4.2 荧光组织化学在探索新基因功能方面的应用 116

6.4.3 绿色荧光蛋白与转基因及基因敲除动物 117

6.4.4 绿色荧光蛋白与基因治疗 119

6.4.5 活细胞荧光杂交 120

7.常用现代组织化学实验指导 123

7.1 酶组织化学实验 123

7.1.1 葡糖-6-磷酸酯(G-6-P)：Wachstein-Meisel法 123

7.1.2 γ-谷氨酰转肽酶(GGT):改良Albert法 123

7.1.3 碱性磷酸酶(AP)：偶氮染料偶联法 123

7.2 免疫组织化学实验 124

7.2.1 免疫荧光法实验 124

7.2.2 免疫酶法实验 125

7.2.3 亲合免疫组化实验 125

7.2.4 免疫电镜实验示教(包埋前-酶标直接法) 126

7.2.5 ELPS法(二步法)检测乳腺癌雌激素受体(ER) 127

7.3 杂交组织化学实验 127

7.3.1 探针标记实验 127

7.3.2 原位杂交 130

7.4 形态定量实验(示教) 132

7.4.1 细胞核二维几何参数的测量 132

7.4.2 胶原免疫组化染色的定量 133

附录Ⅰ 134

一、标本的采集和处理 134

1.活检组织 134

2.手术切除和尸检标本 134

3.细胞标本 134

4.体外培养细胞 134

5.实验动物组织标本 134

二、石蜡切片制作流程 134

三、冷冻切片制作流程 135

1.组织冷冻 135

2.冷冻切片机及切片 135

四、HE染色及常用的衬染方法 136

1.石蜡切片苏木精-伊红染色(HE染色) 136

2.常用的衬染方法 136

五、常用特殊染色方法简介 136

1.胶原纤维染色法--van Gieson苦味酸和酸性品红法 137

2.Masson结缔组织三色染色法 137

3.Weigert弹力纤维染色法 138

4.Gordon-Sweet网状纤维染色方法 138

5.糖原染色--perodic acid schiff染色法(PAS法) 138

6.基膜染色--六胺银法(periodic acid-silver methenamine,PASM法) 139

7.AgNOR的石蜡切片染色法 139

8.核酸染色--酸水解-无色品红法(Feulgen and Rossenbekk) 140

六、常用固定液的配制 140

1.4%甲醛溶液 140

2.乙醇-醋酸-甲醛混合液 140

3.中性缓冲甲醛固定液 140

4.B-5固定液 140

5.4%多聚甲醛固定液 141

6.多聚甲醛-戊二醛(PG)固定液 141

7.多聚甲醛-赖氨酸-过碘酸钠(PLP)固定液 141

8.Carnoy固定液 141

9.Bouin固定液 141

10.Zenker固定液 141

11.2.5%戊二醛固定液 141

12.1%锇酸固定液 141

13.其他固定液 141

七、常用缓冲液的配制 142

1.甘氨酸-HCl缓冲液(0.05mol/L) 142

2.柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/L) 142

3.Na2HPO4柠檬酸缓冲液 142

4.磷酸缓冲液(PB，0.2mol/L) 143

5.醋酸缓冲液(0.2mol/L) 143

6.KH2PO4-NaOH缓冲液(0.05mol/L) 143

7.巴比妥缓冲液 143

8.Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L) 144

9.甘氨酸-NaOH缓冲液(0.05mol/L) 144

10.碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(0.1mol/L) 144

11.二甲砷酸-HCl缓冲液(0.05mol/L) 145

12.Tris-马来酸缓冲液(0.1mol/L) 145

八、常用酶消化液配制 145

1.0.1%胰蛋白酶(trypsin)消化液 145

2.0.2%胃蛋白酶(pepsin)消化液 145

3.0.05%链酶蛋白酶(pronase)消化液 145

4.蛋白酶K(proteinase K)消化液 145

九、免疫组化染色常用显色液 145

1.3，3′-二氨基联苯胺(3，3′-diamino-benzidine,DAB)显色液 145

2.4-氯-1-萘酚(4-chloro-1-naphthol,CN)显色液 146

3.3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole,AEC)显色液 146

4.NBT(nitro blue tetrazolium)和BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)显色液 146

十、常用组织切片粘附剂及使用方法 146

1.白胶液 146

2.多聚赖氨酸(poly-L-lysin,Sigma) 146

3.3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltrietoxysilane,APES) 146

4.铬明矾明胶液 146

5.甲醛-明胶液 146

十一、水溶性封固剂--缓冲甘油明胶液 147

附录Ⅱ 148

重要相关网址 148