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第一章 免疫组织化学组织细胞材料的准备 1

第一节　组织的取材 1

一、动物的致死法及取材 1

二、尸体解剖的取材 1

三、活检标本的取材 2

四、细胞标本的制备 2

第二节　组织的固定 3

一、固定液的种类 4

二、固定的方法 7

三、固定的注意事项 8

四、影响固定的因素 8

第三节　组织的脱水、透明、浸蜡及包埋 9

一、组织的脱水 9

四、组织包埋 10

三、组织浸蜡 10

二、组织的透明 10

第四节　组织切片 11

一、载玻片的处理 11

二、石蜡切片 12

三、冰冻切片 12

四、碳蜡切片 12

参考文献 13

第二章 免疫组织化学的基本技术 14

第一节　抗原、抗体的基础知识 14

一、抗原的概念 14

二、抗原的化学结构及抗原决定簇 14

三、抗原的性质 15

四、抗体的概念 16

五、抗体的性质和种类 16

二、抗体的应用 21

一、抗体的购置 21

第二节　抗体的来源和应用 21

第三节　抗原的暴露和修复 23

一、暴露和修复抗原的原因 23

二、抗原的暴露 23

三、热诱导的抗原修复 25

四、抗原修复的质量控制 28

五、抗原修复存在的问题和克服的方法 28

六、抗原修复和酶消化结合使用 29

第四节 显色系统和衬染方法的选择 29

一、HRP底物显色液的种类和配制 29

二、HRP显示系统的增强方法 32

三、碱性磷酸酶标记的NBT显色液 33

四、衬染剂的选择 34

参考文献 35

第一节　免疫荧光组化技术的基本概念 37

第三章 免疫荧光组织化学技术 37

第二节　荧光素 38

一、荧光染料的发展史和早期应用 38

二、荧光色素 41

三、可用于标记抗体的荧光素 41

四、藻红蛋白 42

第三节　荧光素标记抗体的方法 43

一、标记方法 43

二、荧光抗体的质量控制 47

第四节　免疫荧光组织化学染色方法 49

一、直接法 49

二、间接法 49

三、补体法 51

四、双重免疫荧光细胞化学标记方法 51

二、CSA法 52

一、亲和细胞化学和级联抗体信号放大技术 52

第五节　免疫荧光组织化学的几种增敏方法 52

五、对照试验 52

三、酶标记荧光信号放大技术 55

第六节　荧光显微镜及检测方法 57

一、荧光显微镜的原理 57

二、荧光显微镜的部件 57

三、激发方式 60

四、使用荧光显微镜的注意事项 60

五、荧光显微镜的维护与保养 61

六、荧光显微镜标本制作要求 61

七、荧光图像的记录方法 61

第七节　染色标本的复染、保存及封片介质的制备 62

一、免疫荧光组织化学的细胞核复染 62

二、染色标本的保存 62

三、封片介质的制备 62

参考文献 63

第四章　免疫酶组织化学技术 65

第一节　概述 65

第二节　酶和底物 65

一、酶及其特点 65

二、常用酶及其底物 66

第三节　酶标记抗体法 67

一、标记抗体的制备 67

二、染色的基本原理 68

三、染色步骤 69

四、酶标记抗原法 69

第四节　非标记抗体免疫酶法 70

一、酶桥法 70

二、PAP法 71

第五节 免疫碱性磷酸酶组织化学技术 75

一、间接免疫碱性磷酸酶法 75

第六节　多聚螯合物酶法 76

二、APAAP法 76

二、EnVision法 77

一、EPOS法 77

三、UIP法 78

四、PowerVision法 78

参考文献 79

第五章　亲和免疫组织化学技术 81

第一节　亲和素与生物素系统 81

一、生物素 81

二、亲和素 81

三、链霉亲和素 82

四、基本原理 82

五、操作流程 82

二、酪胺化试剂的制备 85

三、染色步骤 85

一、基本原理 85

第二节　CSA法 85

四、敏感性和存在的问题 87

五、使用CSA技术的技巧 88

第三节　葡萄球菌A蛋白（SPA） 88

一、SPA的性质 88

二、SPA各种免疫检测试剂的制备 89

三、SPA的应用 90

第四节　IHC的标准化和自动化 92

第五节 IHC增敏方法的研究进展及技术改进 93

一、免疫荧光组织化学技术 93

二、免疫酶组织化学技术 94

三、多聚螯合物酶法 94

四、胶体金属－抗体复合物方法 95

五、催化信号放大系统 95

六、滚动式循环放大法 96

七、原位免疫PCR 97

八、提高IHC方法敏感性的辅助手段 98

参考文献 99

第六章 免疫金银组织化学技术 101

第一节　溶胶的基本概念 101

一、胶体金 101

二、胶体金的一般性状 101

第二节　胶体金的制备 102

一、制备前的准备 103

二、胶体金分散颗粒的制备 103

三、胶体金的质量鉴定 106

第三节　胶体金探针的制备 106

一、原理 106

二、待标记蛋白质的准备 106

三、胶体金pH值的调整 106

四、确定胶体金与待标记蛋白质用量 107

六、胶体金标记蛋白质的纯化 108

五、蛋白质的胶体金标记 108

七、胶体金探针的质量鉴定 109

第四节 光镜免疫金组织化学染色方法 110

一、原理 110

二、IGS间接法染色步骤 110

第五节　光镜免疫金银组织化学 110

一、原理 110

二、IGSS操作流程 111

三、双PAG法 112

第六节　彩色免疫金银染色方法 113

一、操作步骤 113

二、CIGSS的优点 114

第七节　物理显影液的配制和IGSS的评估 114

一、物理显影液的配制 114

二、IGSS法的评价及其注意事项 115

参考文献 117

第七章 双重或多重免疫组织化学标记 118

第一节　概述 118

第二节　消除双重染色间交叉反应的方法 118

一、分步固定法 119

二、解离洗脱法 119

三、位点封闭法 119

第三节　光镜下的双重及多重免疫标记染色 119

一、双重或多重免疫荧光标记染色 119

二、双重或多重免疫酶标记染色 122

三、其他双重标记法染色 124

第四节 电镜下的双重及多重免疫标记 125

一、标记方法 125

二、操作 125

第五节 双重或多重标记的注意事项 126

参考文献 127

第八章 免疫组织化学结果的分析和判断 128

第一节　免疫组织化学结果的判断原则 128

第二节　对照染色设计 129

一、阳性对照 129

二、阴性对照 129

三、自身对照 130

第三节　非特异染色 130

一、非特异染色的原因 130

二、消除非特异染色的方法 132

第四节　染色失败的原因及其处置方法 134

一、对照切片和待检组织切片均不着色 134

二、阴性对照切片没有染色，而阳性对照标本和待检测组织切片呈弱阳性 135

三、切片染色太深或整张切片均出现染色 136

四、切片上有许多杂质 136

六、复染色太深或复染和DAB呈色反差太小 137

七、待测组织标本未按所期望的表达（胞质及核） 137

五、没有复染色或复染色过浅 137

八、所有切片包括阴性对照切片均呈现弱阳性反应 138

九、所有切片均出现非特异性背景染色 138

十、阳性对照切片显色良好，而待检测切片均无阳性反应，呈现假阴性 139

十一、待检测切片着色不匀 139

参考文献 140

第九章 原位杂交探针的种类和标记方法 141

第一节　探针的类型和制备 141

一、DNA探针 141

二、RNA探针 141

三、寡核苷酸探针 142

第二节　探针标记的基本原理 142

一、标记物 142

二、标记方法 143

第三节　探针标记的技术 146

三、标记探针的纯化 146

四、标记结果的检验 146

一、核素标记 147

二、生物素标记 147

三、地高辛标记 147

四、荧光素标记 147

五、联合标记 147

六、常用的探针标记技术 148

参考文献 154

第十章 原位核酸分子杂交技术 155

第一节 原位核酸分子杂交技术的原理 155

第二节 原位分子杂交技术的基本方法 156

一、固定 156

二、玻片和组织切片的处理 157

六、对照实验和结果的判断 158

五、显示 158

四、杂交后处理 158

三、杂交 158

第三节　原位DNA分子杂交方法 159

一、地高辛（Dig）标记DNA探针在石蜡切片检测病毒DNA的方法 159

二、生物素标记HPV-DNA探针在石蜡切片上检测HPV-DNA的方法 160

第四节　RNA原位核酸杂交方法 162

一、基本原理 162

二、RNA原位杂交 163

三、cRNA探针检测组织切片中RNA的原位杂交 165

四、冰冻切片的地高辛标记RNA探针的原位杂交操作程序 167

五、用寡核苷酸探针检测组织切片中RNA的原位杂交 168

六、用cDNA探针检测体外培养细胞中RNA的原位杂交 171

第五节　荧光原位杂交（FISH）技术 172

一、FISH的概念 173

二、杂交类型和方法 173

三、杂交失败或杂交信号弱的原因 174

四、可用于FISH检测的探针 175

第六节　原位PCR检测技术 176

一、原位PCR技术特点 176

二、直接法原位PCR扩增 176

三、间接法原位PCR扩增 176

四、应注意的问题 177

五、对照实验 177

第七节 电镜原位核酸分子杂交技术 177

一、概述 177

二、电镜原位杂交的种类 178

三、电镜原位杂交的注意事项 179

四、电镜原位杂交（包埋前、后）操作流程 179

参考文献 180

第十一章 组织芯片的制备和应用 182

第一节　组织芯片的研究进展 182

一、TMA的研究进展 182

一、石蜡块组织芯片的制备 183

第二节　组织芯片的制备 183

二、TMA的分类 183

二、冰冻组织的组织芯片制备 184

三、细胞芯片的制备 185

第三节　组织微阵列的应用 185

一、在肿瘤研究中的应用 185

二、其他方面的应用 189

第四节　TMA的优点和存在的问题 190

一、TMA的优点 190

二、TMA存在的问题 190

三、应用前景和有待解决的问题 191

参考文献 191

第十二章　细胞凋亡的检测技术 194

第一节 细胞凋亡的基本概念和特征 194

一、基本概念 194

二、基本特征 194

第二节 细胞凋亡的形态学检测方法 197

一、HE染色 198

二、甲基绿－派若宁染色法 198

三、吖啶橙染色法 198

四、Hoeehst 33258染色法 199

五、磷脂酰丝氨酸外翻检测方法 199

六、透射电镜观察方法 200

七、其他的检测方法 201

第三节　细胞凋亡的凝胶电泳检测法 201

一、常规方法 201

二、快速法 202

三、连接介导PCR ladder检测 202

第四节　流式细胞仪检测方法 203

一、激光散射光分析 203

二、细胞膜完整性及膜转运功能的测定 203

第五节　细胞器功能的检测 205

第六节　原位末端标记方法 206

一、线粒体跨膜电位的测定 206

二、溶酶体功能的检测 206

一、DNA缺口平移法 207

二、TUNEL检测方法 207

三、TUNEL检测时的注意事项 210

第七节　激光扫描细胞形态分析方法 211

第八节　存在的问题与发展方向 211

一、如何选择细胞凋亡的研究方法 211

二、细胞凋亡和细胞坏死的界定 212

三、其他的检测方法 213

参考文献 213

第十三章　Ig和TCR基因重排检测原理与方法 215

第一节　概述 215

第二节　基因重排的PCR检测 215

一、模板DNA制备 216

三、DNA质量的检测 217

二、DNA浓度和纯度的测定 217

四、DNA的PCR扩增 218

五、PCR产物的电泳和银染 220

六、PCR扩增产物的分析 222

第三节 克隆性基因重排与临床诊断 223

一、克隆性基因重排为提示恶性的重要指标 223

二、克隆性基因重排的敏感性和覆盖面 223

三、克隆性基因重排对区分淋巴瘤T细胞、B细胞来源的作用 223

四、克隆演化 223

五、克隆性基因重排和MRD检测 223

六、克隆性基因重排与交界性淋巴组织增生性疾病 224

七、克隆性基因重排与易发生淋巴瘤的疾病 224

参考文献 224

第二节　免疫电镜技术 225

三、电镜的反差与成像 225

二、分辨率和放大倍数 225

一、工作原理 225

第十四章 电镜细胞化学技术 225

第一节 电子显微镜的基本知识 225

一、免疫电镜技术的基本方法 226

二、透射免疫电镜技术基本操作步骤 227

三、包埋前胶体金标记免疫电镜技术操作流程 228

四、包埋后免疫电镜技术操作流程 229

五、双重或多重免疫电镜标记法 231

六、铁蛋白标记免疫电镜技术 234

七、扫描免疫电镜技术 235

八、冷冻蚀刻免疫电镜技术 236

二、电镜酶细胞化学样品制备流程 237

三、常用酶细胞化学孵育液配方及反应条件 237

一、电镜酶细胞化学基本原理 237

第三节　电镜酶细胞化学技术 237

四、酶细胞化学必须注意的问题 239

第四节 电子显微镜的其他常用细胞化学技术 239

一、离子细胞化学技术 240

二、阴离子位点显示技术 241

三、自由基显示技术 242

四、示踪细胞化学 243

五、凝集素显示糖类细胞化学 243

六、乙酰胆碱受体显示细胞化学 243

七、细胞膜糖类电镜显示法 244

第五节 电镜负染色和免疫放射自显影技术 244

一、电镜负染色技术 244

二、电镜免疫放射自显影术 246

参考文献 249

一、胶原纤维染色 251

二、网状纤维与胶原纤维染色 251

第十五章　常用特殊染色技术 251

第一节　结缔组织染色技术 251

三、弹力纤维与胶原纤维染色 252

四、结缔组织三色染色法 253

五、胶原蛋白、弹力蛋白和黏蛋白染色 253

第二节　肌肉组织染色技术 254

一、横纹肌组织染色 254

二、早期心肌组织病变染色 255

第三节　神经组织染色技术 255

一、神经尼氏体染色 255

二、神经纤维染色 256

三、神经髓鞘染色 256

第四节　脂质染色技术 257

一、油红O染色 257

第五节　糖类染色技术 258

一、糖原染色 258

二、苏丹Ⅲ染色 258

二、黏液物质染色 259

三、羊水角化鳞状上皮的角蛋白染色 259

第六节　色素类染色技术 260

一、含铁血黄素染色 260

二、胆色素染色 261

三、黑色素染色 261

一、纤维素染色 262

第七节　病理的内源性沉着物染色技术 262

四、脂褐素染色 262

二、淀粉样物质染色 263

第八节　病原微生物染色技术 263

一、真菌染色 264

二、细菌染色 264

三、抗酸杆菌染色 265

四、乙型肝炎表面抗原染色 265

一、肥大细胞染色 266

第九节　肥大细胞和钙质染色技术 266

二、钙质染色 267

第十节　核酸染色技术 268

一、DNA染色 268

二、核仁组成区嗜银蛋白染色 268

参考文献 269

第十六章 免疫组织化学常用抗体标记谱系 270

第一节　上皮细胞标志 270

一、广谱上皮标志 270

二、选择性上皮标志 272

第二节　间叶细胞标志 275

一、广谱间叶标志 275

二、肌源性标志 275

三、血管内皮标志 276

六、其他间叶标志 277

五、间皮细胞标志 277

四、纤维组织细胞标志 277

第三节　神经组织标志 278

一、广谱神经标志 278

二、选择性神经标志 279

第四节　神经内分泌细胞标志 280

一、垂体激素 280

二、胰岛激素 280

三、甲状腺激素 281

四、其他激素 281

第五节　淋巴造血细胞标志 281

一、广谱淋巴细胞标志 281

二、B淋巴细胞标志 282

三、NK/T淋巴细胞标志 284

四、霍奇金细胞相关标志 285

五、其他标志 286

第六节　肿瘤相关抗原 288

第七节　细胞增殖标志 289

第八节　细胞凋亡抗体 290

第九节　癌基因和抑癌基因相关抗体 291

第十节　肿瘤细胞耐药标志 293

第十一节　性激素受体标志 294

第十二节　细胞黏附分子抗体 295

第十三节　病原微生物抗体 296

参考文献 296

第十七章 免疫组织化学在病理诊断及研究中的应用 297

第一节　肿瘤分类中的应用 297

一、上皮细胞及其肿瘤 298

二、间叶细胞及其肿瘤 299

三、神经源性肿瘤 300

五、淋巴造血组织肿瘤 302

四、神经内分泌肿瘤 302

第二节 肿瘤免疫组织化学鉴别诊断 305

一、小圆细胞肿瘤 305

二、梭形细胞肿瘤 306

三、上皮样肿瘤 307

四、多形性肿瘤 308

五、腺泡状肿瘤 308

六、黏液样肿瘤 309

七、转移性肿瘤 309

第三节　肿瘤细胞耐药性中的应用 310

一、P-糖蛋白 310

二、多耐药相关蛋白 310

三、肺耐药相关蛋白 311

四、拓扑异构酶 311

五、谷胱甘肽S转移酶 311

一、概述 312

第四节　肿瘤性激素受体中的应用 312

六、金属硫蛋白 312

七、药物代谢酶类——胸苷酸合成酶 312

二、雌激素受体 313

三、孕激素受体 313

四、雌激素调节蛋白 313

五、雄激素受体 313

第五节　肿瘤细胞增殖活性中的应用 313

一、生长分数 313

二、增殖活性与预后 313

三、增殖活性与治疗 314

第六节　肿瘤细胞凋亡中的应用 315

第七节　肿瘤相关基因中的应用 316

一、癌基因 316

二、肿瘤抑制基因 318

二、EB病毒（EBV） 319

三、乙型肝炎病毒（HBV） 319

一、人乳头状瘤病毒（HPV） 319

第八节　病原微生物检测 319

四、幽门螺杆菌（HP） 320

参考文献 320

第十八章 肿瘤免疫组化标记的形态学特征及其意义 321

第一节 阳性标记的显色特征 321

一、阳性标记的色度特征 321

二、阳性标记的强度特征 322

三、阳性细胞的量化标准 323

第二节　抗原在细胞中的定位 323

一、胞膜型表达 324

二、胞核型表达 326

三、胞质型表达 329

四、胞膜－质型表达 331

五、胞核－质型表达 332

一、局灶型 333

第三节　阳性标记的组织学特征 333

三、片块型 334

四、网状型 334

二、弥漫型 334

五、腺管型 335

六、腔缘型 335

七、其他类型 336

第四节　阴性结果及其意义 336

一、完全阴性 337

二、部分阴性 337

第五节　影响抗原定位的主要因素 337

一、组织结构不清晰 337

第六节　肿瘤抗原异常表达 338

一、肿瘤细胞不同分化阶段异常表达 338

三、非特异染色的干扰 338

二、组织细胞特殊结构 338

二、肿瘤细胞抗原异位表达 339

三、肿瘤细胞异常分化 340

四、抗体交叉反应 341

五、肿瘤细胞吸附和吞噬 341

参考文献 342

一、IHC常用方法操作流程 343

附录Ⅰ 免疫组织化学和原位杂交常用操作流程 343

附录 343

二、原位杂交操作流程 347

附录Ⅱ 免疫组织化学常用缓冲液 350

附录Ⅲ 原位杂交组织化学常用试剂及配制 353

附录Ⅳ　各种市售常用酸碱的浓度 355

附录Ⅴ 玻璃及塑料器皿的硅烷化 355

附录Ⅵ 蛋白质含量的测定方法 356

附录Ⅶ　X-gal染色方法 357