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目录 1

绪言 1

一、细胞与细胞培养 1

二、细胞培养的发展史 2

三、细胞生物学与培养细胞学 3

四、培养细胞学的研究内容 4

五、培养细胞学的常用术语 6

第一篇　导论 9

第一章　培养细胞生物学 9

第一节　组织来源与培养 9

二、正常或肿瘤组织来源 10

一、胚胎或成体组织来源 10

三、培养细胞的生长与增殖 11

第二节　器官培养物的分化与发育 13

一、培养环境对细胞分化的作用 14

二、组织细胞间的相互作用 15

三、诱导物与肿瘤细胞间的相互作用 15

四、病毒、致癌剂和分化 16

第三节　培养细胞的遗传学特征 16

一、培养细胞的遗传学 16

二、细胞遗传学检测技术及应用 17

第四节　细胞系或细胞株的建立 18

一、基本概念 18

二、建立细胞系（株）的鉴定要求 19

三、建立细胞系（株）的鉴定结论 21

第二章　细胞培养的基本条件 23

第一节　实验室设计及设备器材 23

一、细胞培养室设计原则及要求 23

二、设备器材 24

第二节　实验器材的处理 25

一、清洗 25

二、包装 27

三、消毒灭菌 27

第三节　培养用液 29

一、细胞培养对水的要求 29

二、平衡盐溶液 30

三、细胞培养常用试剂 32

四、常用培养液 34

五、培养液的选择与应用 37

第三章　基本技术 38

第一节　无菌技术 38

第二节　标本材料的选择和处理 39

第三节　细胞的制备 39

一、单细胞悬液的制备 39

二、细胞分离法 40

三、细胞计数法 41

四、细胞活性的检查 41

五、细胞的分装 41

第五节　细胞形态学检查法 42

一、利用倒置显微镜观察细胞的形态和结构 42

第四节　细胞培养与传代 42

二、利用荧光显微镜观察细胞的形态和结构 45

三、利用电子显微镜观察细胞的形态和结构 47

第六节　无血清培养液的设计和合成 51

一、实验原理 51

二、无血清培养液的设计方法 52

三、配制方法 52

第七节　细胞的冻存、复苏与运输 54

一、细胞的冻存 54

二、细胞的复苏 55

三、细胞的运输 56

第八节　细胞培养的放大试验（生产） 56

一、细胞培养时污染的检测 57

第九节　细胞培养时污染的检测、排除 57

二、微生物污染的排除 60

第二篇　细胞培养技术 61

第四章　动物细胞培养 61

第一节　概述 61

第二节　禽类动物细胞培养 62

一、鸡胚成纤维细胞的制备和培养 62

二、鸡胚神经细胞培养法 62

三、鸡胚心脏块的制备与培养 64

第三节　啮齿类动物细胞培养 65

一、小鼠乳腺上皮细胞的制备与培养 65

二、小鼠骨髓细胞的制备与培养 67

三、大鼠肝细胞培养法 68

四、新生大鼠心脏细胞的制备与培养 70

五、成年大鼠心室肌肉细胞的制备与培养 72

六、大鼠胰岛细胞培养法 73

第四节　兔细胞培养 76

一、新生兔肾细胞的制备与培养 76

二、新生兔软骨细胞培养法 77

三、兔胚动脉平滑肌细胞的制备与培养 78

四、兔胚气管上皮的制备与培养 80

第五节　动物血管内皮细胞的制备与培养 81

第五章　人细胞培养 87

第一节　人胚肾细胞的制备与培养 87

第二节　人胚肺二倍体细胞的制备与培养 88

第三节　人表皮角质形成细胞及真皮成纤维细胞的培养 89

第四节　人血管内皮细胞的制备与培养 90

第五节　淋巴细胞的分离培养与分化 92

一、基本原理 92

二、淋巴细胞的分离和激化 93

三、EB病毒转化淋巴细胞 94

第六节　人支气管上皮细胞的原代培养 95

第六章　干细胞的培养 97

第一节　饲养层细胞与条件培养液的制备 97

一、小鼠胚胎成纤维细胞的培养和制备 97

二、小鼠成纤维细胞系STO饲养板的制备 98

第二节　胚胎干细胞的培养 99

一、小鼠胚胎干细胞的分离与培养 99

二、鸡胚干细胞的培养与体外分化 101

三、猪胚胎干细胞的分离与培养 102

四、人胚脑组织干细胞的直接分离和培养 103

第三节　成体干细胞的培养 104

一、成体神经干细胞的培养及诱导分化 104

二、间充质干细胞的培养 105

三、表皮组织干细胞的培养 108

第四节　胚胎干细胞的建系 109

一、胚胎干细胞分离材料的获取与处理 109

二、胚胎干细胞的分化抑制培养 109

三、胚胎干细胞的生物学性状与鉴定 111

四、胚胎干细胞系的建立与保存 112

第一节　肿瘤细胞培养技术 115

第七章　肿瘤细胞的培养 115

第二节　肿瘤细胞的原代培养 116

第三节　体外培养肿瘤细胞的生物学检测 117

一、核型分析 117

二、软琼脂培养 118

三、异体动物接种法 118

第四节　肿瘤细胞的建株 118

第五节　常见肿瘤细胞的传代与保存 119

一、常见肿瘤细胞的传代 119

二、肿瘤细胞的保存 120

第三篇　培养细胞学研究 123

第八章　培养细胞的分析 123

第一节　细胞融合 123

一、病毒诱导细胞融合法 124

二、聚乙二醇诱导细胞融合法 125

三、电诱导细胞融合法 126

第二节　细胞同步化法 127

第三节　细胞克隆 129

一、细胞克隆培养技术 129

二、影响克隆形成率的因素 131

第四节　培养细胞的转化 133

第五节　细胞凋亡 136

一、原理 136

二、细胞凋亡的形态学检测法 137

三、细胞凋亡的生物化学检测法 138

四、诱导细胞凋亡的免疫化学检测法 140

五、bcl-2基因的抗凋亡作用 141

第六节　流式细胞分选术 142

第七节　细胞酶活性测定 145

一、酸性磷酸酶 145

二、葡萄糖-6-磷酸酶 146

三、琥珀酸脱氢酶 147

四、DNA与RNA的吖啶橙荧光染色法 148

五、DNA的孚尔根染色法 148

第九章　亚细胞器的分离 150

第一节　细胞膜的分离 151

第二节　微粒体的分离 151

第三节　线粒体的分离 154

一、原理 155

第四节　核糖体、核糖体亚基和多核糖体的分离和纯化 155

二、动物细胞核糖体、多核糖体及核糖体亚基的分离 156

三、细菌核糖体制备及大、小亚基的分离 157

第五节　RNA的提取 159

第六节　RNA的Northern杂交分析 162

第七节　细胞核、核仁的分离和纯化 164

第八节　高尔基体的分离和分析 166

第十章　细胞器蛋白质和基因的显示 169

第一节　免疫荧光显微术 169

一、荧光显微镜及其附属设备 169

二、抗体标记 170

三、荧光染料 171

第二节　用酶标法检测细胞内蛋白质的定位 172

第三节　核蛋白的免疫荧光定位 175

一、原理 175

二、直接免疫荧光法测抗原 175

三、间接免疫荧光法测抗体 176

第四节　比较基因组杂交 177

第五节　荧光标记染色体原位杂交 179

第六节　RNA原位杂交 182

第四篇　培养细胞信息学研究 185

第十一章　细胞信息的传递与调控 185

第一节　细胞信号的种类 185

一、物理信号 185

二、化学信号 186

第二节　信号转导受体的分类 188

三、生物信号 188

一、离子通道型受体 189

二、G蛋白偶联受体 189

三、具有酶活性的催化性受体 190

四、细胞内受体 191

第三节　细胞内信号分子 191

一、偶联蛋白 191

二、G蛋白 192

三、第二信使 193

四、非受体酪氨酸蛋白激酶 193

五、丝裂原活化蛋白激酶 194

六、蛋白激酶 194

八、磷酸酶 195

七、磷脂酶 195

第四节　胞内与胞间信息研究 196

一、细胞间信息传递及调控 196

二、细胞内信息传递系统 199

三、细胞核内信息传递及调控 202

第十二章　大分子的制备和导入细胞 204

第一节　小鼠卵细胞和胚胎的显微注射 204

第二节　外源基因在哺乳动物细胞中转导和表达 210

一、待转染细胞的准备 211

二、质粒DNA的纯化 212

三、外源基因导入哺乳动物细胞中的技术方法 213

四、转染细胞的筛选 223

一、免疫荧光抗体法检测表达蛋白质 229

第三节　基因表达产物的检测 229

二、免疫沉淀法检测表达蛋白质 230

三、Western杂交分析检测表达蛋白质 233

第十三章　代谢标记和蛋白质修饰 238

第一节　32P磷酸稳态标记法 238

第二节　mRNA体外细胞核连缀转录分析 240

第三节　用透化细胞及透化细胞器研究蛋白质的磷酸化 245

第四节　蛋白质的甲基化和异戊烯化作用 250

第五节　蛋白质的糖基化 252

第十四章　蛋白质表达和相互间作用 256

第一节　T7表达系统的蛋白质产生及检测 256

第二节　用GST基因融合载体表达和纯化蛋白质 259

一、概述 260

第三节　哺乳动物细胞表达系统 260

二、脂质体介导的DNA瞬时转染 261

三、DEAE-葡聚糖介导的瞬时转染 262

第五篇　细胞培养的应用研究 265

第十五章　细胞培养在功能与分化研究中的应用 265

第一节　基本概念 265

一、细胞分化 265

二、细胞分化的机制 266

第二节　培养细胞诱导功能表达与分化的实验 266

一、体外定向诱导胚胎干细胞分化为造血细胞 267

二、小鼠骨髓与脾来源树突细胞的分离与培养 268

三、小鼠3T3细胞向脂肪细胞的分化 270

四、体外诱导肝癌细胞株产生酪氨酸转氨酶 272

五、U937细胞的分化 274

六、恶性畸胎瘤细胞的分化 276

七、小鼠黑色素瘤B16细胞的分化诱导 277

八、神经母细胞瘤LA-N-5细胞的分化诱导 278

九、EB病毒壳抗原和早期抗原在体外细胞表达的检测 279

第十六章　细胞培养在病毒学研究中的应用 282

第一节　概述 282

一、检测病毒 282

二、病毒性感染的血清学诊断 283

三、肿瘤病毒致癌机制的研究 283

第二节　病毒的分离与鉴定 284

一、用于病毒分离的细胞种类 284

四、制备病毒疫苗 284

二、病毒接种法及结果观察 285

三、TCID50病毒感染性测定法 286

四、病毒定量法（蚀斑形成试验） 288

第三节　中和试验测定抗病毒抗体（微量法） 289

一、原理 289

二、蚀斑减少法 289

三、细胞病变法测中和抗体 290

第四节　体外抗病毒药效实验 291

第五节　在病毒受体及致病机制研究方面的应用 292

一、概述 292

二、受体蛋白免疫血清的细胞保护性实验 293

一、人工诱发细胞恶性转化 295

第十七章　细胞培养在肿瘤学研究中的应用 295

第一节　体外培养细胞的恶性转化 295

二、试管内诱发癌实验法 297

第二节　肿瘤细胞浸润与转移的检测 299

一、原理 299

二、肿瘤细胞电泳速度测定 299

三、快速体外浸润实验 300

四、球体器官培养侵袭实验 301

第三节　肿瘤细胞端粒酶活性检测 302

第四节　肿瘤细胞癌基因及抑癌基因检测 304

一、聚合酶链反应-单链构象多态性分析法 305

二、聚合酶链反应结合寡核苷酸探针杂交法 308

第五节　肿瘤细胞体外药物敏感性检测 309

一、四噻唑蓝法药物敏感试验 310

二、致死细胞染色法药敏试验 311

三、3H-TdR掺入法药物敏感试验 312

第六节　肿瘤多药耐药基因及其表达产物的检测 313

一、研究肿瘤多药耐药基因及其表达产物的意义 313

二、常见肿瘤多药耐药基因mdr1及其表达产物P-gp的检测方法 314

第十八章　细胞培养用于免疫学实验 319

第一节　杂交瘤克隆及单克隆抗体制备 319

一、杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理 319

二、骨髓瘤细胞的选择 319

三、小鼠-小鼠B细胞杂交瘤技术 320

一、树突细胞的体外制备与功能测定 323

第二节　免疫细胞的体外制备与功能测定 323

二、人自然杀伤细胞克隆的制备与活性测定 325

三、T细胞克隆的制备与功能测定 327

四、人巨噬细胞的获取与功能测定 329

第三节　淋巴细胞体外增殖反应实验 332

一、丝裂原刺激的淋巴细胞增殖反应 332

二、混合淋巴细胞培养 333

第四节　免疫效应细胞毒实验 334

一、形态学检查法 335

二、125I-UdR掺入法 336

三、乳酸脱氢酶释放法 337

四、四噻唑蓝法检测细胞毒活性 337

一、IL-1活性测定 338

第五节　细胞因子的检测 338

二、IL-2活性测定 339

三、IL-3活性测定 343

四、IL-4活性测定 343

五、IL-6活性测定 344

六、IL-11活性测定 344

七、IL-12活性测定 345

八、IL-13活性测定 346

九、IFN活性测定 346

十、TNF的检测方法 348

十一、GM-CSF活性测定 351

一、细胞免疫网络概述 352

二、T细胞网络 352

第六节　细胞免疫网络调节研究 352

三、B细胞网络 353

四、杀伤细胞网络 353

五、细胞因子网络 353

六、T细胞、B细胞检测方法 354

第七节　HLA检测 355

一、HLA抗体筛选技术 355

二、HLA抗原单克隆抗体分型技术 359

第十九章　细胞培养在药理学研究中的应用 363

第一节　测定药物对培养细胞生长影响的实验 363

一、绘制生长曲线的细胞培养实验 363

三、有丝分裂指数测定的细胞培养实验 364

二、成集落的细胞培养实验 364

四、缩时电影显微摄像术的细胞培养实验 365

第二节　培养细胞或器官的放射自显影术和同位素液闪测定实验 366

一、培养细胞的放射自显影术实验 366

二、原位缺口平移的细胞或组织培养实验 368

三、放射性同位素液闪测定的细胞培养实验 369

第三节　培养细胞动作电位记录实验 371

一、培养的神经细胞动作电位记录实验 371

二、培养的心肌细胞收缩活动和动作电位记录实验 372

第四节　培养细胞的膜片钳技术检测实验 373

一、简介 373

二、心肌细胞的膜片钳全细胞记录实验 376

三、心肌细胞的穿孔膜片钳全细胞记录实验 379

四、脑薄片膜片钳记录实验 381

第五节　药物对培养神经细胞影响的检测实验 383

一、培养神经细胞蛋白质总量的流式分析实验 383

二、培养神经细胞的电特性测定实验 384

三、培养神经细胞的免疫组化研究实验 386

四、大鼠胎鼠皮质神经细胞原代培养实验 387

第六节　检测神经生长因子与营养因子生物活性的体外实验 388

一、交感神经节和脊神经节培养检测实验 388

二、PC 12细胞培养检测实验 389

三、神经营养因子基因表达的细胞培养研究 390

第七节　心肌细胞培养在药理学研究中的应用 391

一、乳鼠原代心肌细胞培养法 392

二、乳鼠心肌细胞的实际应用 394

三、成年大鼠心肌细胞培养方法 396

第八节　检测培养的内皮细胞分泌的某些活性物质的实验 398

一、药物对培养的血管内皮细胞血管内皮舒张因子／一氧化氮合酶活性影响的实验 398

二、纤溶酶原激活物测定实验 399

三、纤溶酶原激活物抑制剂活性测定实验 402

四、血栓调节蛋白活性测定实验 403

五、血管性血友病因子测定实验 404

六、药物对培养的白细胞与内皮细胞黏附影响的实验 405

七、细胞培养用于血管内皮细胞表面黏附分子P选择素的测定 407

八、内皮细胞-单核细胞黏附率的测定实验 408

第九节　细胞培养用于抗动脉粥样硬化药物研究的实验 409

一、血管内皮细胞保护药实验 409

二、血管平滑肌细胞增殖抑制药实验 412

三、建立泡沫细胞模型的实验 414

第十节　细胞培养用于影响血糖药物研究的实验 416

一、脂肪细胞对葡萄糖的转运实验 416

二、脂肪组织及脂肪细胞对葡萄糖的转化实验 417

三、胰岛素对离体犊牛小肠上皮细胞增殖及吸收功能影响的实验 418

第十一节　细胞培养用于影响生殖功能药物的实验研究 419

一、黄体细胞培养实验 419

二、精子穿卵实验 420

三、促黄体生成素对睾丸功能影响的间质细胞培养实验 421

第二十章　细胞毒性及遗传毒性检测 423

第一节　细胞毒性检测 423

一、细胞计数法 423

二、台盼蓝拒染试验 424

三、四噻唑蓝试验 425

四、中性红试验 426

五、结晶紫试验 426

六、乳酸脱氢酶漏出率 427

七、细胞中蛋白质含量测定 429

八、细胞内还原型谷胱甘肽含量测定 430

九、脂质过氧化产物生成量测定 431

十、细胞DNA合成测定（3H掺入法） 431

十一、细胞形态观察法 432

第二节　遗传毒性检测 433

一、哺乳类细胞基因突变实验 433

二、人外周血淋巴细胞染色体畸变分析 436

三、人体外周血淋巴细胞微核形成实验 438

四、姊妹染色单体交换实验 439

五、非程序性DNA合成实验 441

六、DNA链断裂检测（彗星实验） 443

七、DNA加合物检测 445

八、DNA链间交联检测 447

第二十一章　功能性细胞的制备 449

第一节　胎肝细胞的制备与应用 449

第二节　免疫活性淋巴细胞的制备与应用 452

一、外周血单个核细胞的分离及淋巴细胞纯化 452

二、淋巴细胞组分分离 455

三、T细胞亚群分离 458

四、自然杀伤细胞的分离 461

五、LAK细胞/TIL的制备和活性测定 462

第三节　胰岛细胞的制备与应用 464

第四节　甲状腺细胞的制备与应用 465

第五节　神经细胞的制备与应用 467

一、神经元分离培养 467

二、神经胶质细胞的培养 468

第六节　造血干细胞的制备与应用 472

附录 479

附录一　实验室常用的细胞系（株） 479

附录二　常用人工合成细胞培养液 480

附录三　细胞培养及相关实验常用缓冲液 481

附录四　离心速度和离心力换算表 483

索引 484