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第一章 培养细胞的生存条件和环境 1

第一节 体外细胞生存的营养条件 1

一、水 1

二、无机盐类 2

三、糖类 3

四、维生素 4

五、氨基酸 6

六、温度 7

七、氧和酸碱度 8

八、细胞之间的相互联系 10

第二节 培养用液 12

一、水与缓冲液 12

二、生理盐水与平衡盐溶液 15

第三节 培养基 16

一、发展史 16

二、物理化学特征 18

三、完全培养基 20

四、血清培养基和血清的选择 21

五、其他添加物 27

第四节 无血清培养基 31

一、使用含血清培养基的缺点 31

二、无血清培养基的优缺点 32

三、无血清培养基的血清替代 35

四、无血清培养基的选择与制备 38

第五节 体外细胞的生长环境 41

一、体外培养实验室 41

二、体外培养的设备与器具 45

第二章 培养细胞的生物学特性 51

第一节 细胞黏附 51

一、吸附和接触 51

二、贴壁 51

三、铺展 52

第二节 细胞增殖 52

一、细胞周期 52

二、细胞增殖和培养细胞的生命分期 55

第三节 细胞分化 58

一、细胞分化潜能的变化 58

二、体外培养细胞分化状态的维持 58

第四节 细胞去分化 59

第五节 能量代谢 59

第六节 细胞系的演化 60

第七节 连续细胞系的形成 61

第八节 体外培养细胞的生长类型 62

一、黏附型细胞 62

二、悬浮型细胞 64

第三章 细胞培养实验室的布局 66

第一节 实验室规划及使用布局 66

一、总体原则 66

二、细胞培养实验室的组成与布局 66

第二节 无菌操作设施和工作间 68

一、常用的无菌操作设施 68

二、细胞培养工作间 68

第三节 实验室设备 69

第四节 器械及消耗性物品 72

一、手术器械 72

二、消耗性物品 73

第四章 无菌技术 77

第一节 概述 77

一、目标 77

二、灭菌操作 77

三、层流标准 78

四、方法 79

五、仪器和设备 82

第二节 准备与灭菌 82

一、设备、试剂和培养基 83

二、培养基的质控、检测和储存 90

第三节 清洗和消毒 92

一、培养用具的清洗 92

二、培养用品的消毒和灭菌 93

第五章 细胞分离技术 102

第一节 利用细胞体积和密度差异进行细胞分离纯化 102

一、一步密度梯度离心法 102

二、等密度梯度离心法 105

第二节 根据细胞表面电荷的细胞分离纯化 110

一、自由流动电泳分离技术 110

二、密度梯度电泳分离技术 111

第三节 利用细胞表面标志进行细胞分离纯化 111

一、免疫溶解法 111

二、盘化法 113

三、凝集素凝集法 115

四、玫瑰花环分离法 117

五、流式细胞分选术 120

六、免疫磁珠分离技术 124

第四节 利用其他细胞学特性分离纯化细胞的方法 125

一、反复植块法 125

二、有丝分裂抑制剂处理 125

第六章 细胞培养观察和检测技术 128

第一节 显微镜技术 128

一、普通显微镜的构造及使用方法 128

二、相差显微镜的构造及使用方法 130

三、荧光显微镜的构造及使用方法 132

四、激光共聚焦显微镜的原理、构造及应用 134

五、透射电子显微镜与超薄切片技术 137

六、扫描电子显微镜与样品制备 139

七、显微摄影技术 140

八、活细胞的动态观察与缩时电影 141

第二节 细胞及细胞成分染色及显示 142

一、苏木素伊红（Hematoxylin and Eosin，HE）染色法 142

二、吉姆萨（Giemsa）染色法 143

三、载玻片处理方法 143

四、活细胞体外活体染色观察与活体染料 143

五、细胞中糖类和脂类的显示 144

六、细胞中过氧化物酶的显示 146

七、细胞中一氧化氮合酶的显示 146

八、细胞中琥珀酸脱氢酶的显示 147

九、细胞中酸性磷酸酶的显示 147

十、细胞中碱性蛋白的显示 148

十一、细胞中线粒体的活体染色 149

十二、微丝的染色及形态观察 149

十三、胞质微管的间接免疫荧光显示技术 150

十四、细胞中DNA与RNA的吖啶橙荧光染色法 151

十五、细胞中DNA的富尔根（Feulgen）染色法 151

第七章 细胞培养基本技术 154

第一节 细胞传代和换液 154

一、原代培养 154

二、继代培养 157

三、细胞换液 158

第二节 细胞培养的基本方法和技术 159

一、悬滴培养法 159

二、盖玻片培养法 159

三、培养瓶培养法 160

四、培养板培养法 160

五、旋转管培养法 161

六、灌注小室培养法 162

七、二倍体细胞培养法 165

八、克隆培养法 165

九、中空纤维细胞培养技术 166

十、微载体细胞培养法 168

十一、微囊培养技术 169

第三节 细胞活性及计数 170

一、活细胞的染料排除检测法 170

二、细胞增殖活性测定的3H-TdR掺入法 171

三、细胞活力测定的MTT比色法 171

四、细胞生长曲线 172

五、细胞计数法 173

第四节 细胞的冻存和复苏 176

一、冷冻保存的必要性 176

二、培养物的冷冻保存与复苏原理 176

三、冷冻及复苏方法 178

第八章 细胞培养特殊技术 182

第一节 细胞克隆 182

一、克隆培养技术 182

二、影响克隆形成率的因素 186

三、克隆的分离 188

第二节 定量细胞计数 189

一、细胞重量 189

二、DNA含量 190

三、蛋白质含量 190

四、细胞计数术 191

五、重复取样问题 191

第三节 细胞周期与细胞同步化 191

一、细胞周期 192

二、细胞周期分析 194

三、细胞同步化 198

第四节 细胞融合 201

一、细胞融合的基本技术 201

二、融合细胞的筛选 206

三、融合细胞的克隆化 207

四、细胞融合的杂交瘤 208

第五节 细胞凋亡的测定 209

一、凋亡细胞普通光镜下形态观察 209

二、凋亡细胞荧光显微镜下形态观察 209

三、凋亡细胞电镜下形态观察 209

四、凋亡细胞琼脂糖凝胶电泳检测——DNA梯状条带（DNA Ladder） 210

五、凋亡细胞的原位末端标记法检测 210

六、凋亡细胞的流式细胞法检测 210

七、磷脂酰丝氨酸外化的流式细胞术分析 211

第六节 细胞遗传学性状检测 211

一、性染色质检测 211

二、培养细胞染色体显示法 212

三、染色体结构显示和检测 213

四、染色体基因定位 215

五、染色体显微切割法 217

第七节 杂交瘤技术与单克隆抗体制备技术 218

一、杂交瘤技术 218

二、单克隆抗体 222

第八节 基因转染技术与体外细胞转化 226

一、基因转染技术 227

二、体外细胞转化 232

第九章 常用医用细胞培养 236

第一节 呼吸系统上皮细胞培养 236

一、人支气管上皮细胞培养 236

二、兔呼吸道纤毛上皮细胞培养 238

三、小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞培养 240

四、人鼻咽上皮细胞培养 242

第二节 消化系统上皮细胞培养 244

一、人食管黏膜上皮细胞培养 244

二、人胃黏膜上皮细胞培养 246

三、小肠黏膜上皮细胞（IEC）培养 248

四、大鼠胰腺导管上皮细胞培养 251

第三节 腺上皮细胞培养 254

一、人涎腺上皮细胞培养 254

二、牛乳腺上皮细胞培养 258

第四节 表皮细胞培养 261

一、人皮肤角质形成细胞的无血清培养 261

二、人表皮黑色素细胞培养 262

第五节 血管内皮细胞培养 264

一、人脐静脉血管内皮细胞培养 264

二、人肾小球微血管内皮细胞体外培养 266

三、猪血管内皮细胞体外培养 268

四、人眼脉络膜血管内皮细胞体外培养 270

五、大鼠脑微血管内皮细胞培养 272

第六节 胸腺上皮细胞培养 279

第七节 结缔组织细胞培养 283

一、结缔组织细胞生物学特点 283

二、结缔组织细胞分离方法 287

三、成纤维细胞培养 288

四、巨噬细胞培养 302

五、脂肪细胞培养 307

六、肥大细胞培养 311

七、间充质干细胞培养 316

第八节 肌肉组织细胞培养 321

一、心肌细胞培养 321

二、平滑肌细胞培养 340

三、骨骼肌细胞培养 348

第九节 眼组织细胞培养 359

一、角膜上皮细胞和内皮细胞培养 359

二、小梁细胞培养 363

三、视网膜色素上皮细胞培养 366

四、晶状体上皮细胞培养 370

五、视网膜米勒细胞培养 372

第十节 骨与软骨组织细胞培养 378

一、成骨细胞培养 378

二、破骨细胞培养 384

三、滑膜细胞培养 386

四、软骨细胞培养 388

第十一节 泌尿、生殖系统细胞培养 391

一、肾小球系膜细胞培养 391

二、肾小管上皮细胞培养 394

三、睾丸支持细胞培养 396

四、睾丸间质细胞培养 397

五、生精细胞培养 399

第十二节 内分泌细胞培养 400

一、胰岛细胞培养 400

二、人垂体腺细胞培养 401

三、甲状腺细胞培养 402

第十三节 羊水细胞培养 403

一、羊水细胞培养的基本方法 403

二、羊水细胞的富集培养法 404

第十四节 神经组织细胞培养 406

一、神经元培养 406

二、星形胶质细胞培养 412

三、少突胶质细胞培养 413

四、施旺细胞培养 415

五、小胶质细胞培养 416

六、其他神经胶质细胞的培养——嗅鞘细胞体外培养 419

七、体外培养神经组织分离细胞的形态学特征比较 422

第十五节 造血祖细胞培养 426

一、造血祖细胞培养的实验材料 426

二、造血祖细胞的富集与分离 431

三、造血祖细胞的培养技术 435

第十六节 淋巴细胞培养 438

一、各类淋巴细胞的主要特征 439

二、淋巴细胞的体外培养方法和应用 446

三、淋巴细胞的体外长期培养 454

第十七节 胚胎干细胞培养 457

一、体外培养胚胎干细胞的技术原理 458

二、体外培养胚胎干细胞的基本过程 458

三、胚胎干细胞的鉴定 466

第十章 常用肿瘤细胞培养 476

第一节 肿瘤细胞在体内外生长特性概论 476

一、肿瘤细胞体内生长的特征 476

二、肿瘤细胞体外生长的生物学特性 478

三、肿瘤细胞在体内和体外的生长特性差别 479

第二节 肿瘤组织细胞培养方法 480

一、肿瘤组织细胞的原代培养 480

二、肿瘤细胞的传代 483

三、肿瘤细胞的克隆培养法 485

第三节 部分肿瘤细胞系的建立和体外培养 486

一、人鼻咽癌细胞系（CNE2）的建立和体外培养 486

二、人骨肉瘤细胞系（HOS-8603）的建立和体外培养 487

三、人胃癌细胞系的建立和体外培养 488

四、人卵巢癌细胞系的建立和体外培养 490

五、人白血病／淋巴瘤细胞系的建立和体外培养 491

六、人脑肿瘤细胞系的建立和体外培养 493

七、人神经母细胞瘤细胞系的建立和体外培养 495

八、人肝癌细胞系的建立和体外培养 497

九、人乳腺癌细胞系的建立和体外培养 498

十、人肺腺癌细胞系的建立和体外培养 500

第四节 肿瘤细胞培养的应用 502

一、肿瘤细胞对组织浸润的体外研究 502

二、人恶性肿瘤细胞的动物移植瘤研究 504

第十一章 细胞规模培养 508

第一节 单层规模培养 508

一、转管及转瓶培养 508

二、旋转圆柱管培养 509

第二节 悬浮规模培养 509

一、细胞对悬浮培养的适应 509

二、规模培养的方法 510

第三节 细胞规模培养中的问题、对策及展望 511

第十二章 细胞培养过程中的污染及处理 513

第一节 污染途径 513

第二节 污染对细胞的影响 514

第三节 微生物污染的判断 517

一、微生物污染的一般特征及判断 517

二、细菌的污染及其判断 518

三、真菌的污染及其判断 518

四、支原体的污染及其判断 519

五、病毒的污染及其判断 523

第四节 交叉污染 524

第五节 污染的预防 525

一、从空气方面来预防 525

二、从生物材料方面来预防 525

三、从试剂方面来预防 525

四、从仪器设备和装置方面来预防 525

五、从操作技术方面来预防 526

第六节 污染的处理 526

一、抗生素的应用 527

二、加温除菌法 528

三、动物体内接种 528

四、巨噬细胞吞噬法 529

五、其他方法 529

第十三章 细胞培养的常见问题及对策 531

第一节 细胞生长缓慢 531

一、培养液 531

二、消化液 532

三、传代 532

四、污染 532

第二节 某些不稳定的试剂配制 532

一、谷氨酰胺 532

二、胰蛋白酶 532

三、血清 533

四、培养基中的其他成分 533

第三节 培养基各种成分的纯度 533

一、纯水器 533

二、塑料制品 533

三、玻璃器皿 534

四、血清 534

五、碳酸氢钠 534

第四节 化学污染 534

一、对于来自玻璃器皿的化学污染的对策 534

二、对于来自吸液管的化学污染的对策 534

三、对于来自试剂的化学污染的对策 535

四、对于来自粉末或气溶胶的化学污染的对策 535

第五节 其他 535

一、冻存细胞成颗粒性 535

二、成活率 535

附录 537

附录1 中外细胞库及其所提供的细胞目录 537

一、中国典型培养物保藏中心细胞库及其可提供的细胞目录 537

二、中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库可供的细胞目录 542

三、美国典型物保藏中心细胞库及其可提供的细胞目录 553

附录2 细胞培养常用培养用液配方 564

一、缓冲液的配制 564

二、消化液的配制 565

三、抗生素液的配制 566

四、其他溶液的配制 566

五、细胞培养常用培养液的配制 567

附录3 两种常用的公式 569

一、细胞计数公式 569

二、离心力的计算 570