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目 录 1

第一章载体－宿主体系 1

质粒 1

在质粒中进行克隆 9

噬菌体λ 13

裂解循环 13

溶源性 16

λ噬菌体载体的构建 17

选择合适的载体 18

噬菌体λ载体图 19

粘粒 29

单链噬菌体 41

噬菌体M13载体 42

总结 43

第二章细菌菌株与病毒的繁殖和保存 46

菌株的检验 46

单菌落的分离 46

细菌菌株的生长、保存和保藏 48

噬菌体λ噬菌斑的纯化 49

从单斑制备噬菌体λ原液 50

培养基和抗生素 52

液体培养基 52

含琼脂或琼脂糖的培养基 54

抗生素 54

感染 57

第三章噬菌体λ和质粒DNA的分离 57

噬菌体λ的大量制备 57

诱导 58

噬菌体λ的提纯 59

噬菌体λDNA的提取 62

质粒DNA的大量分离 63

细菌的生长和质粒的扩增 63

菌体的采集和裂解 64

利用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心提纯闭环DNA 66

从质粒DNA制品中去除RNA 67

限制酶 69

同裂酶 69

第四章分子克隆中所用的酶 69

甲基化作用 70

用限制酶消解DNA 74

分子克隆中使用的其它酶类 75

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 76

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段 79

T4 DNA聚合酶 82

用T4多核苷酸激酶标记DNA 5′末端 86

依赖于RNA的DNA聚合酶 90

DNA的脱磷酸作用 93

核酸酶Bal 31 95

核酸酶Sl 97

核糖核酸酶类 98

绿豆核酸酶 98

核酸外切酶Ⅶ 99

核酸外切酶Ⅲ 99

脱氧核糖核酸酶Ⅰ 99

λ核酸外切酶 101

多聚（A）聚合酶 101

T4 DNA连接酶 102

T4 RNA连接酶 102

EcoRI甲基化酶 103

末端脱氧核苷酸转移酶 103

第五章凝胶电泳 104

琼脂糖凝胶电泳 104

缓冲液 106

凝胶电泳槽 106

琼脂糖凝胶的制备 110

琼脂糖凝胶中DNA的染色 111

摄影技术 112

微型凝胶 112

从琼脂糖凝胶中回收DNA 113

碱性琼脂糖凝胶 117

聚丙烯酰胺凝胶电泳 118

聚丙烯酰胺凝胶的制备 118

从聚丙烯酰胺凝胶中分离DNA片段 121

分离链的凝胶 121

利用聚丙烯酰胺凝胶分离链 122

利用琼脂糖凝胶分离链 123

利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离短的双链DNA的链 124

第六章真核细胞mRNA的抽提、提纯和分析 126

哺乳动物细胞mRNA的分离 128

细胞总RNA的分离 129

多聚（A）+RNA的选择 131

RNA的凝胶电泳 132

RNA的核酸酶Sl定位 137

第七章 cDNA的合成和克隆 140

cDNA的合成 140

第一cDNA链的合成 140

第二cDNA链的合成 141

利用核酸酶Sl切割发夹环 142

双链cDNA的分子克隆 143

同聚物尾序 143

合成的DNA接头 144

克隆cDNA的其它方法 145

cDNA克隆的策略 148

高丰度mRNA 148

低丰度mRNA 148

cDNA克隆的程序 151

双链cDNA的合成 151

用核酸酶Sl消解 156

双链cDNA的克隆 157

将载体和双链cDNA进行退火 159

通过依次加合接头来克隆双链cDNA 160

利用质粒DNA转化大肠杆菌 163

利用氯化钙程序转化 163

第八章将质粒和噬菌体λDNA引入大肠杆菌 163

利用氯化钙／氯化铷程序转化 164

大肠杆菌χ1776的转化 165

噬菌体λDNA的离体包装 167

噬菌体λ溶源菌的保持和测定 168

包装抽提物制备方案Ⅰ 169

离体包装方案Ⅰ 170

包装抽提物制备方案Ⅱ 171

离体包装方案Ⅱ 173

噬菌体λ载体中基因组文库的构建 175

第九章基因组文库的构建 175

载体DNA的制备 178

从组织培养生长的细胞中分离大分子量真核DNA 181

真核DNA 20 kb片段的制备 182

连接和包装 184

文库的扩增 188

粘粒载体基因组文库的构建 189

磷酸酯酶处理的粘粒载体中的克隆 190

用两种限制酶消解和磷酸酯酶处理过的粘粒载体中的克隆 192

粘粒文库的扩增、贮存和筛选 195

第十章重组克隆的鉴定 198

细菌菌落或噬菌斑的原位杂交 198

筛选小量细菌菌落 199

将菌落复印在硝酸纤维素滤膜上 201

利用杂交筛选噬菌体λ噬菌斑 202

噬菌体λ噬菌斑原位扩增后通过杂交进行筛选 204

固定在滤膜上的DNA或RNA与放射性探针杂交 205

与带有噬菌斑或菌落复印的硝酸纤维素滤膜杂交 206

利用杂交选择来鉴定cDNA克隆 208

利用与硝酸纤维素相结合的DNA进行杂交选择 208

杂交选择的RNA在网织红细胞裂解液中转译 215

注入到蛙卵母细胞的信使RNA的转译 219

利用大肠杆菌中的重组，从噬菌体λ文库中筛选特异性DNA序列 221

利用重组进行选择的原理 221

在W3110r-m+（p3）（πVX）上进行噬菌体λ文库平板测定 224

含有校正基因的噬菌体的遗传测定 224

在πVX筛选中使用的菌株 224

W3110 r-m+（p3）的转化 224

πVX的制备 224

πVX系统的测定 225

πVX系统的利用 227

第十一章重组体DNA克隆的分析 228

质粒或噬菌体λDNA的快速分离 228

快速分离小量质粒DNA 228

快速分离小量噬菌体λ DNA 230

作限制酶切位点图 232

一次和多次消解作图 232

依次消解 233

部分消解 234

Southern转移 236

DNA从琼脂糖凝胶转移到硝酸纤维素滤膜上 237

Southern滤膜杂交 239

小片段DNA次级克隆到质粒载体中 241

利用粘性末端次级克隆DNA片段 241

在次级克隆中利用合成的DNA接头 241

连接两个平端末端DNA分子以创建限制性位点 245

进行快速依次克隆的步骤 246

第十二章在大肠杆菌中表达克隆DNA的载体 248

启动子 248

利用噬菌体λPL启动子的载体 249

其它启动子 251

核糖体－结合位点 251

真核基因的表达 252

表达非融合的真核蛋白的载体 252

表达融合的真核蛋白的载体 257

克隆基因的最大表达 265

增加基因剂量 265

总结 266

附录 267

1：生化技术 267

玻璃器皿和塑料器皿 267

液体培养基 268

有机试剂的配制 268

用于噬菌体λ工作的溶液 270

抗生素 271

缓冲液和溶液的配制 273

蛋白水解酶类 274

酶类 274

限制酶消解缓冲液 276

常用电泳缓冲液 276

常用凝胶载样缓冲液 277

透析管的准备 278

从乙醇和水混合液中干燥32P－标记的核苷酸 278

核酸的纯化 279

核酸的浓缩 280

Sephadex G-50层析 282

DNA和RNA的定量 284

放射自显影 285

核酸中放射性的测量 287

制备质粒多种聚合体作为分子量参照物 288

用Maxam-Gilbert技术定序的方案 288

2：pBR322 291

pBR 322的核苷酸序列 291

pBR 322的限制切点 299

pBR 322 DNA的限制片段 304

3：常用细菌菌株 314

4：厂商地址和产品简介 315

参考文献 319